Diagnóstico Citogenético y Molecular PDF

Comisión 18 26/11/24 Comisionista 1: Mónica Rivero Méndez Corrector: Borja González López Comisionista 2: Alba Rodríguez Arranz Genética Humana Docente: Fabián Lor...

Comisión 18 26/11/24 Comisionista 1: Mónica Rivero Méndez Corrector: Borja González López Comisionista 2: Alba Rodríguez Arranz Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz TEMA 7: DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO Y MOLECULAR. 1. Introducción. Hoy comenzamos con un tema nuevo bastante importante en la actualidad. En primer lugar, iniciamos este tema con el título “mejor prevenir que curar”, ¿a qué nos referimos con este refrán?: - Diagnóstico: lo relacionamos con curar, por lo tanto, la persona ya está enferma. - Cribados: hace alusión a la palabra prevenir. ¿Qué son los cribados? Son técnicas de análisis genético que se aplican para predecir lo que puede ocurrir en un futuro, con el fin de prevenir. Esta imagen ilustra las 8 razones por las que se podría encajar un diagnóstico (aunque hay muchas más razones). 2. Indicaciones para realizar pruebas genéticas. ¿A qué conjunto de la población podemos aplicarles análisis genéticos a modo de cribado? 1  Comisión 18 26/11/24 Comisionista 1: Mónica Rivero Méndez Corrector: Borja González López Comisionista 2: Alba Rodríguez Arranz Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz - Individuos asintomáticos (aquellos que no tengan una patología): a día de hoy se aplican los cribados de portadores, con el fin de encontrar heterocigóticos, especialmente en enfermedades monogénicas (recordar que los patrones de herencia para una enfermedad monogénica son: autosómico dominante o recesivo, ligados a cromosomas sexuales…). Este tipo de análisis de cribados de portadores, se enfoca fundamentalmente en enfermedades monogénicas mendelianas con patrones de herencia recesivos (ligados a X o autosómicos). ¿Por qué recesivos?: porque son difíciles de detectar en la población general. Valga como ejemplo que usted es portador de la enfermedad, pero como son necesarias la dos copias para que pueda manifestar la sintomatología, como cuenta con un solo alelo defectuoso no la va a manifestar. No obstante, si tiene descendencia y su pareja también es portadora de la enfermedad, hay una probabilidad del 25% de que su hijo tenga los dos alelos recesivos para esta enfermedad, y por tanto, manifieste la sintomatología. - Mujeres embarazadas y neonatos: en ese caso aplicamos las técnicas tanto de cribado y diagnóstico (pre y post natal). Usamos los cribados prenatales tanto para embarazadas como para los individuos pre-natales a modo preventivo, o ya en el caso de individuos post-natales se utilizan pruebas diagnósticas (dado que ya tiene una patología). - Individuos con alguna enfermedad: el paciente ya presenta una sintomatología, y se quiere conocer su causa, ver si hay influencia de variantes genéticas para esa patología… 2  Comisión 18 26/11/24 Comisionista 1: Mónica Rivero Méndez Corrector: Borja González López Comisionista 2: Alba Rodríguez Arranz Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz 3. Cribados de portadores heterocigóticos. Es importante conocer los siguientes aspectos sobre el cribado de portadores heterocigotos: - Cribado en la población para variantes genéticas que pueden causar enfermedades mendelianas a los descendientes de una persona portadora. - Los portadores son sanos, pero muestran un riesgo sustancial (25% o mayor) de tener hijos con un trastorno autosómico recesivo o ligado al cromosoma X. - Técnicas asequibles como la PCR o secuenciación Sanger (1º generación, donde se amplificaba una región de entorno a 1000 de bases y se podía secuenciar), dirigidas a alelos frecuentes en poblaciones específicas. EXAMEN: ¿SÓLO SE UTILIZAN ESTAS TÉCNICAS PARA EL CRIBADO? NO, HOY EN DÍA SE LLEVAN A CABO ESTAS TÉCNICAS, PERO COMO SABEMOS DE CLASES ANTERIORES HAY TÉCNICAS DE 2º GENERACIÓN, 3º GENERACIÓN; LAS CUALES TAMBIÉN PUEDEN SER UTILIZADAS… ¿SE PODRÍAN UTILIZAR PARA ESTUDIAR A PORTADORES DE VARIANTES PATOGÉNICAS EN POBLACIONES SANAS? POR SUPUESTO. - Ejemplo: detección de heterocigotos en gen HEXA para la enfermedad de Tay-Sachs (deterioro neurológico progresivo y fallecimiento a los 2-4 años de edad). Uno de cada 27 judíos de origen asquenazí (una pequeña población de judíos que viven en el este de alemania) es portador de un alelo de riesgo. Los individuos que tienen esta enfermedad presentan una inserción de 4 bases en una región codificante (al ser de más de tres bases, lo que va a ocurrir es que aparezca un codón de parada prematuro y por tanto la proteínas va a acortar). Por tanto, se ha utilizado en esta población el cribado de portadores, para determinar el riesgo completo de una pareja a tener un hijo con esta enfermedad. La incidencia de neonatos afectados: 100 veces mayor que en otras poblaciones (las pruebas de cribado de portadores y el diagnóstico prenatal ha reducido la incidencia un 65-85%). 3  Comisión 18 26/11/24 Comisionista 1: Mónica Rivero Méndez Corrector: Borja González López Comisionista 2: Alba Rodríguez Arranz Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz 4. Cribado/Diagnóstico prenatal (personajillos 👶🏻 ). En esta situación, como se mencionó anteriormente podemos hacer uso de técnicas de cribado como de diagnóstico. - Datos previos tales como: Antes de realizarlos se deben tener en cuenta algunos factores como por ejemplo: la edad de la madre y del padre (en la acondroplasia, la edad del padre es crucial , dado la cantidad de mutaciones que se producen en la espermatogénesis con el avance de la edad). Es importante recalcar, que a las mujeres mayores de 38 años se les incluye en un programa de cierto riesgo a tener descendencia con aneuploidía. Con respecto a la gráfica, podemos ver cómo a partir de los 38 años el riesgo de que nazca un individuo con síndrome de Down va aumentando considerablemente. Así pues, también es importante conocer los antecedentes familiares o personales de trastornos cromosómicos o monogénicos. - Predicciones por cribado prenatal: Las mujeres que están embarazadas entran en un programa determinado, en los que las técnicas que se aplican son no invasivas (como las ecografías, la prueba del azúcar, las analíticas). Estas pruebas son útiles a partir de la semana 12. 4  Comisión 18 26/11/24 Comisionista 1: Mónica Rivero Méndez Corrector: Borja González López Comisionista 2: Alba Rodríguez Arranz Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz Aunque, para evitar esperar hasta la semana 12 para poder ver el desarrollo del individuo, podemos hacer uso del cribado por análisis del DNA fetal libre (todavía no se está utilizando en España), ya que a partir de la 7ª semana de embarazo entre el 2-10% de ADN circulante en sangre corresponde a ADN fetal. Ese ADN fetal libre puede ser LC o líquido placentario, aunque es importante mencionar que en mujeres embarazadas hay ADN fetal libre circulante en sangre periférica. En cualquiera de nosotros, hay ADN libre circulante en sangre que proviene de lisis, por tanto, en estadíos de embarazo podemos encontrar ese ADN fetal. Estos cribados prenatales no invadimos (CPNI) a través de secuenciación masiva de ADN (NGS) y/o PCR cuantitativa (qPCR) nos permiten detectar aneuploudías (estableciendo ratios matemáticamente sabiendo la longitud de los cromosomas y que somos diploides), deleciones, inserciones, reorganizaciones cromosómicas, variaciones en el número de copias, sexo, Rh y variantes patogénicas puntuales (p.ej.: variantes en el gen FGFR3 que derivan en acondroplasia) del feto. Si tuviésemos un resultado positivo, es necesario confirmarlo mediante técnicas invasivas (p.ej: biopsias). Esta técnica novedosa también se puede utilizar para pacientes con cáncer (con tumores sólidos o líquidos, detectando ADN circulante del tumor en sangre periférica) o que no tengan cáncer, pero con el fin de diagnosticar antes de tiempo, ya que no tengo que esperar a que se forme masa considerable de células tumorales (para poderlo ver haciendo uso de técnicas de imagen) para detectar que hay o habrá cáncer, evitando además procedimientos invasivos que en algunos casos entraña demasiados riesgos (p.ej.: biopsias de cánceres de cerebro como el glioblastoma). Las biopsias líquidas (muestras de ADN circulante del tumor a partir de sangre periférica) ya son una realidad en oncología, aunque realmente podríamos aplicarlo a prácticamente cualquier otro campo (p.ej.: para detectar enfermedades autoinmunes) puesto que esta técnica nos remite detectar ADN de cualquier célula que se haya roto y por tanto liberado su ADN hacia el torrente sanguíneo. En resumen, las técnicas genéticas nos permiten anticiparnos (el profesor comenta que incluso años) a los diagnósticos y por tanto ganar tiempo. - Diagnóstico prenatal basado en técnicas invasivas: La amniocentesis (obtención de células a partir del líquido amniótico) es la más habitual, se realiza entre las 16 y 20 semanas de gestación y, pese a que supone riesgo de aborto, es más segura que la biopsia de vellosidades coriónicas o BVC (se obtiene mayor cantidad de células que con la amniocentesis), que se realiza a las 10-13 semanas de gestación. 5  Comisión 18 26/11/24 Comisionista 1: Mónica Rivero Méndez Corrector: Borja González López Comisionista 2: Alba Rodríguez Arranz Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz A partir de estas muestras se realizan técnicas de análisis genético, donde si ya se tiene ADN fetal libre, en lugar de secuenciar todo el genoma nos dirigimos directamente a las regiones donde hay sospecha de mutación mediante PCR (diseñando cebadores específicos). Las más usadas son: Hibridación Fluorescente In Situ (FISH), usada para detección rápida de aneuploidías en los cromosomas 13, 18, 21, X e Y. CGH y microarrays (desnaturalizando e hibridando ADN prediseñado con el ADN del paciente), para detección de CNVs, duplicaciones y deleciones (con mayor resolución que el cariotipado), disomías uniparentales (los cromosomas homólogos y/o cromátidas hermanas proceden del mismo progenitor, dependiendo si es isodisomía o heterodisomía) y pérdida de heterocigosidad (pérdida de regiones heterocigóticas. Si un bloque grande de ADN carece de posiciones heterocigóticas podríamos deducir que se ha producido una duplicación, que los progenitores pueden tener cierto grado de parentesco, que el individuo tiene una poliploidía, que hay isodisomías o, en menor grado, heterodisomías, o que se ha producido una deleción). También se podrían emplear otras técnicas como la secuenciación masiva. Sin embargo, hay que tener en cuenta que, en ambas técnicas, las células obtenidas son placentarias, y estas no están sometidas a selección natural o presión selectiva (ya que la placenta es un órgano de un solo uso), sino que sólo lo están las células precursoras de gametos y las células que componen al feto; por tanto, podemos obtener falsos resultados (tanto positivos como negativos) debido a que las mutaciones sean exclusivamente de las células placentarias por mosaicismo respecto a las del feto (es decir, las variantes genéticas detectadas están en la placenta pero no en el feto). 5. Pruebas de cribado neonatal La técnica de cribado neonatal por excelencia en España es la prueba del talón, en la que se analizan metabolitos en recién nacidos presintomáticos para detectar enfermedades de base metabólica congénitas en las que el tratamiento precoz puede prevenir o aliviar sus consecuencias mediante pruebas bioquímicas como la espectrometría de masas o la cromatografía (CRIBADO DE PRIMER NIVEL). Si el neonato fuese positivo sí se podría plantear cribado de segundo nivel, es decir, determinación directa del genotipo para confirmar el diagnóstico. En Canarias, la prueba del talón incluye el cribado de 28 enfermedades endocrino-metabólicas, y se pretende aumentar este número a 42 enfermedades en el futuro próximo. Además, una compañera comenta que hoy en día va acompañada de una 6  Comisión 18 26/11/24 Comisionista 1: Mónica Rivero Méndez Corrector: Borja González López Comisionista 2: Alba Rodríguez Arranz Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz muestra de sangre periférica de la madre en el momento del parto, y otra de sangre del cordón umbilical. El profesor destaca entre ellas estas 8 enfermedades metabólicas, poniendo de ejemplo la Fenilcetonuria (PKU), dada en temas previos: COMI X: 1. Indique cuál de las siguientes afirmaciones es cierta en relación al cribado de portadores: a. Todas son correctas. b. Consiste en la búsqueda de variantes genéticas patogénicas en individuos de la población que pueden transmitir enfermedades mendelianas a los descendientes. c. Ninguna es correcta. d. Los portadores son sanos, pero muestran un riesgo reducido (25% o menor) de tener hijos con un trastorno autosómico recesivo o ligado al cromosoma X grave. e. La frecuencia de individuos portadores es homogénea, razón por la que la incidencia de neonatos afectados es comparable entre diferentes grupos de población. 2. Indique cuál de las siguientes afirmaciones es cierta en relación al diagnóstico genético preimplantacional : a. La fecundación in vitro presenta un mayor riesgo de padecer enfermedades epigenéticas debidas a la impronta genómica defectuosa b. Permite el diagnóstico de anomalías cromosómicas por FISH y microarray, y enfermedades monogénicas por PCR c. Se basa en técnicas de citogenética para seleccionar gametos sin alteraciones genéticas d. Ninguna es correcta e. Todas son correcta 7  Comisión 18 26/11/24 Comisionista 1: Mónica Rivero Méndez Corrector: Borja González López Comisionista 2: Alba Rodríguez Arranz Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz 3. Indique cuál de las siguientes afirmaciones es cierta en relación al diagnóstico sintomático basado en herramientas genómicas: a. Independientemente del tipo de mutaciones a detectar (somáticas vs línea germinal), se debe garantizar la misma cobertura de secuenciación. b. Se pueden dirigir a regiones concretas del genoma (whole-exome sequencing, WES) pero también a todos los genes del genoma (targeted sequencing). c. La aplicación de esta tecnología supone costes elevados aunque no requiere de personal cualificado. d. Existen estrategias para analizar múltiples muestras (p. ej. varios pacientes) de manera simultánea. e. Permiten identificar variantes de interés por secuenciación masiva de ADN, sólo a partir de muestras obtenidas mediante métodos no invasivos Respuestas: 1.d, 2.e, 3.d 8