Chapitre 5 : Copie du patrimoine génétique PDF

Chapitre 5 : Copie du patrimoine génétique Les génomes peuvent évoluer au cours du temps. C’est un processus évolutif cst. On va voir ce qui régit cette plasticité. Watson et Crick : modèle de réplication semi conservative de l’ADN. Les 2 doubles hélices générées après réplication de l’ADN contien...

Chapitre 5 : Copie du patrimoine génétique Les génomes peuvent évoluer au cours du temps. C’est un processus évolutif cst. On va voir ce qui régit cette plasticité. Watson et Crick : modèle de réplication semi conservative de l’ADN. Les 2 doubles hélices générées après réplication de l’ADN contiendront un brin ancien et un brin nouveau. D’autre modèles ont été proposés mais non validés. La chimie de la synthèse d’ADN : Les nucléosides triphosphates sont caractérisés par un désoxyribose (pas de grpt OH contrairement au nucléotide 3P impliqué dans l’ARN). On retrouve les phosphates alpha, béta et gamma. Le alpha sera le seul impliqué dans la liaison phosphodiester. La synthèse d’ADN nécessite une jonction amorce matrice. La matrice est le brin d’ADN qui va être répliqué. L’amorce est le morceau d’ADN (en vert) relativement court, complémentaire d’une partie de la matrice. Il présente une extrémité 5’P et une extrémité 3’OH. Dans cette jonction amorce matrice, ce qui est important c’est le 3’OH à la fin. On a la matrice avec le squel sucre-P, auquel sont attachées des bases azotées via les liaisons glycosidiques avec le carbone O’ du désoxyribose. On a en face un autre brin d’ADN : l’amorce (= primer en anglais). Cette amorce forme par complémentarité des liaisons H entre les bases complémentaires. On retrouve l’OH au niveau du C3’. Ce dernier va être important dans l’ajout de nouveaux désoxyribonucléotides pour compléter l’amorce, qui sert uniquement à initier la réplication. L’oxygène de l’OH va réaliser une attaque Nu- sur la 1er P du désoxyribonucléoside, il va ainsi libérer un pyrophosphate (béta et gamma). Cette attaque Nu- va conduire à la formation d’une liaison phosphodiester entre les sucres. La libération du pyroP va conduire à la libération d’énergie (lien énergétique entre P béta et gamma). Il va ainsi y avoir ajout d’un nucléotide, dont l’extrémité 3’OH va servir à l’ajout du nucléotide suivant. On parle de la polymérisation de l’ADN dans le sens 5’ 3’ du brin en cours de synthèse. Comme les brins sont anti//, le Template (matrice) se lit dans le sens 3’5’. Les 2 activités catalytiques de l’ADN polymérase : Zoom au niveau de l’enzyme qui catalyse la synthèse de cette molécule d’ADN : l’ADN polymérase. Au niveau de son site catalytique, on voit bien au niveau du site catalytique la réaction proprement dite. On a le dernier nucléotide du primer (3’OH) et le nucléotide suivant. T forme 2 ponts H avec A par complémentarité. Dans le site catalytique de l’ADNp, il a une forme particulière pcq le site catalytique va assurer dans une certaine mesure l’ajout correct de nucléotides. Si les bases ne sont pas complémentaires, il n’y aura pas de formation de ponts H mais commet s’assurer qu’on n’aura pas de liaison phosphodiester entre les sucres ? C‘est lié à la conformation du site catalytique, qui fait que si on a un mauvais nucléotide au niv du site catalytique, on aura un mauvais ralliement du phosphate alpha avec le OH (ils sont trop loin). Quand le pont H est formé, le P est parfaitement positionné par rapport au OH et permet l’attaque nucléophile et donc la formation de la liaison phosphodiester. On permet ainsi la formation de la bonne paire, l’insertion du bon nucléoside 3P. Dans le noyau, il y a aussi des ribonucléosides triP. La transcription de l’ADN en ARN peut avoir lieu n’importe quand (sauf mitose) alors que la réplication de l’ADN a lieu pdt la phase S. Ainsi, pdt la phase S on peut avoir à la fois une réplication de l’ADN et sa transcription en ARN. On va donc dans le cytoplasme avoir des désoxyribonucléosides-triP et des ribonucléotides triP. Or on fabrique plus d’ARN que d’ADN donc on a besoin de + d’éléments de base pour fabriquer l’ARN que pour l’ADN. L’ADNp risque donc de se retrouver dans son site catalytique avec des ribonucléotides triP au niveau de son site catalytique, mais elle peut les discriminer. La différence entre les 2 nucléosides triP est la présence du grpt OH en 2’ (uniquement dans les ribonucléotides triP). Si un ribonucléoside-triP vient se placer dans le site catalytique, il va pouvoir former des ponts H avec la matrice mais la présence du OH en 2’ va encombrer la « poche » et empêcher l’alignement parfait du phosphate avec le OH. Ça va entrainer un décalage du P alpha et il n’y aura pas d’attaque Nucléophile et donc pas de liaison phosphodiester puisque l’OH est en face du O et pas du P. L’enzyme sert à catalyser la formation des liaisons phosphodiester. On peut schématiser l’ADNp sous la forme d’une main avec 4 doigts. On voit la matrice en gris et le brin naissant en vert. Les doigts sont impliqués dans l’activité catalytique. Dans le creux, on va maintenir l’association forte entre l’ADNp et la matrice. Les nucléotides doivent être ajoutés les uns après les autres, il ne faut pas en sauter. Pour s’assurer que les nucléotides soient copiés les uns après les autres dans le bon ordre, la pliure va plier le brin matrice pour que le bon nucléotide soit copié (celui qui est à l’intérieur de la pliure). Mais il y a malgré tout des erreurs. La synthèse d’ADN est un processus très rapide : 1000 nucléotides/s. Cette vitesse est liée à la processivité : nb de nucléotides qu’une ADNp peut ajouter par événement de liaison. L’ADNp va se lier à sa matrice puis elle va ajouter des nucléotides avant de se détacher. La fixation de l’ADNp à sa matrice prend 1s (très long). Si elle n’était pas processive, il faudrait 1s pour s’attacher puis 1ms pour synthétiser un nucléotide, la copie d’un génome humain prendrait bcp trop de temps car on a 3 milliards de nucléotides à copier (3M chez une bactérie). Il est nécessaire que l’ADNp puisse synthétiser un certain nbr de nucléotides avant de se détacher. Mais comme c’est rapide, il y a un risque d’erreur. Il existe le système de correction d’épreuve. 2nd activité catalytique, par un 2ème site. Elle va polymériser dans le sens 5’3’, à chaque ajout de nucléotide, elle vérifie que c’est le bon. Si ce n’est pas le cas, elle revient en arrière, elle efface ce qu’elle vient de faire grâce à une activité 3’5’ exonucléase. Cette activité va découper l’ADN par une extrémité 3’ qu’elle génère. Elle va couper le lien phosphodiester entre le nucléotide qu’elle a ajouté et le nucléotide précédent puis reprend son activité 5’3’ polymérase. En moyenne, elle fait une erreur tous les 100 000 nucléotides. Son activité exonucléase lui permet de corriger ce taux d’erreur de 10-5 à 10-7. Grâce à cette activité proof Reading, il n’y aura plus qu’une erreur tous les 10M nucléotides, ce qui reste important. Des systèmes de réparation permettent de limiter ces erreurs à 10-10. Retenir ce qui est en bleu. Il y a chez les procaryotes et les eucaryotes pls ADNp (eucaryotes > procaryotes). Chez les procaryotes, une seule polymérase va répliquer l’ADN pdt la phase S. Les autres vont être impliquées dans des systèmes de réparation. Chez les eucaryotes, la plupart des polymérases sont impliquées dans les systèmes de réparation. La polymérisation de l’ADN pdt sa réplication est assurée par la polymérase delta et epsilon. L’une est dédiée à la copie d’un des brins, l’autre à l’autre alors que chez les procaryotes les 2 brins sont copiés par la même ADNp. L’initiation de la réplication de l’ADN : Initiation de la réplication. Elle a lieu pdt la phase S du cycle cellulaire. Il y a une régulation pour que ça n’ait pas lieu à d’autres moments. L’initiation de la réplication de l’ADN se fait au niveau d’un réplicateur (séquences essentielles présentes à des endroits précis du génome). Chez les procaryotes, à 1 seul endroit du CH circulaire, pls chez les eucaryotes, au min 1 réplicateur/CH mais en réalité il y a pls réplicateurs par CH pour que la réplication se fasse rapidement. Le réplicateur est reconnu par l’initiateur : prot qui se lie au réplicateur et permet le début de la polymérisation de l’ADN àpd l’origine de la réplication (dans le réplicateur). Une fois l’initiateur lié, d’autres prot seront recrutées pour permettre l’initiation de la réplication de l’ADN. Chez les procaryotes, l’initiateur est appelé DNA-A (doit être associé à de l’ATP) lorsqu’il se lie, il provoque la fusion de la région voisine (séparation des 2 brins). Dès qu’elle est séparée en 2 simples brins, il y a recrutement d’un premier acteur qui va se placer autour de chaque simple brin : hélicase, qui va hydrolyser les ponts H entre les bases complémentaires. L’initiateur associé à l’ATP va se lier à une séquence dite 9-mer car répétition de 9 nucléotides. Le DNA-A va se lier et provoquer la fusion de la région voisine, constituée de la répétition de 13 nucléotides. Cette fusion provoque le recrutement de l’hélicase grâce au chargeur d’hélicase. Ce dernier va ouvrir le donut multimère (hélicase) pour le mettre autour du simple brin d’ADN. Une série d’acteurs sont recrutés. Il va y avoir la polymérisation qui va créer des fourches de réplication : endroit où es 2 brins d’ADN sont séparés. L’hélicase progresse vers chaque extrémité (3’). Ainsi la polymérisation de l’ADN est bidirectionnelle, elle se fait apd d’une origine de réplication. Une fois la réplication de l’ADN commencée, les 2 polymérases vont partir dans 2 directions opposées car ADN anti//. Ça va permettre de doubler la vitesse de réplication de l’ADN puisque ça se fait dans les 2 sens en même temps. DNA-A doit être lié à l’ATP mais en plus, pour qu’il puisse se lier à l’ADN, l’ADN doit être bi-méthylé, cad que les 2 brins d’ADN doivent être méthylés. Ici, ce sont certaines adénine de l’ADN procaryotes qui sont méthylées. Il s’agit des adénines présentes au niveau de la séquence GATC. L’adénine de ces séquences est méthylée par une méthyltransférase (Dam- méthylase). La condition pour que DNA-A lié à l’ATP lie le réplicateur, c’est que les séquences GATC de ce réplicateur soient bi-méthylées. Un fois DNA-A lié, on a ouverture de la région voisine puis réplication de l’ADN. Ainsi, la réplication commence au niveau du réplicateur. Les brins néosynthétisés sont respectivement complémentaires au brin du dessus et du dessous, on génère donc 2 doubles brins. Le nv brin n’est pas méthylé au niveau des GATC dès le début car la prot seqA va se lier dès que l’ADNp est passé au niveau des séquences GATC. La présence de cette prot va constituer un obstacle à la méthylase, qui ne pourra pas méthyler l’adénine des GATC du nouveau brin. Ce brin restera non méthylé un certain temps (statut hémi-méthylé). Ainsi DNA-A ne pourra plus réinitier une réplication de l’ADN avant que seqA se détache et que les séquences GATC soient méthylées. Une fois qu’on est à nouveau dans un statut bi-méthylé, DNA-A peut à nouveau initier la réplication d l’ADN. En plus de ce niveau de régulation, il y a d’autres niveaux de régulation. La transcription de DNA-A est régulée (on contrôle son expression). Ces niveaux de régulations permettent de s’assurer que la réplication de l’ADN ne va commencer qu’ à un moment. Chez les eucaryotes, l’initiateur ORC (origine recognition complexe) va reconnaitre le réplicateur. La liaison de ORC au réplicateur ne provoque pas la fusion de la région voisine. Dès que ORC est lié, il va recruter les chargeurs d’hélicases, qui existaient déjà chez les procaryotes. Une fois les chargeurs d’hélicase recrutés, les hélicases sont recrutées. Le chargeur d’hélicase va ouvrir le donut puis le refermer (idem procaryotes). Quand ce complexe est formé, on n’a pas initiation de la réplication directement, on appelle cela le complexe pré-RC. Ce complexe est formé pdt la phase G1 (avant la phase S). Une régulation va contrôler l’activité de ce complexe : activité hélicase qui va séparer les 2 brins. L’activation du complexe pré-RC va se faire grâce à la CDK (cycling dépendent kinase : kinase dépendant d’une cycline) et la DDK. Ces kinases phosphorylent les chargeurs d’hélicase. Cela va provoquer une modification de leur conformation et une moindre affinité pour le complexe. Les chargeurs d’hélicase vont donc se libérer du complexe. Cette libération des chargeurs d’hélicase va activer l’activité des hélicases, qui vont hydrolyser les ponts H pour séparer les 2 brins. D’autres prot sont recrutées au niv de ce site. Des facteurs et les ADNp delta et sigma sont recrutés. L’activation du complexe est dépendant de l’activité de kinase qui vont phosphoryler les chargeurs d’hélicases. Le complexe pré-RC est formé en G1 et activé en phase S. ll existe des mécanismes qui s’assurent que le complexe pré-RC ne puisse pas être formé pdt la phase S, G2 ou la mitose. Ainsi, une fois le complexe pré-RC activé, il n’y en a plus qui se forme avant le stade G1 du cycle cellulaire suivant. Un CH eucaryote est donc répliqué 1 fois/cycle cellulaire. Chez les eucaryotes, il y a pls CH, qui sont plus grands que les CH bactériens. Les CH eucaryotes sont linéaires (présence d’extrémités). On voit sur cet exemple 5 origines de réplication (pas forcément équidistants). On va avoir formation et activation du complexe pré-RC. Tous les complexes pré-RC ne sont pas activés en même temps. La réplication va commencer uniquement au niveau des réplicateurs activés. La réplication est bidirectionnelle. Ainsi, la polymérase (n°3) va progresser et répliquer la région correspondant au réplicateur numéro 2. L’origine de réplication n°2 va être répliquée passivement car ça ne dépend pas de l’activation de son pré-RC mais au passage de la polymérase activée au niveau du site n°3. - Réplication active : complexe pré-RC correspondant activé - Réplication passive : réplication par une polymérase activée ailleurs Une fois qu’une origine de réplication a été répliquée (activement ou passivement) elle ne sera plus répliquée, pas d’activation possible du complexe pré-RC. Il y a une réplication bidirectionnelle qui peut commencer à pls endroits du CH, mais un système de sécurité fait en sorte que chaque région soit répliquée 1 seule fois par cycle. Réplicateur = séquences nécessaire à l’initiation de la réplication de l’ADN. Origine de réplication (située dans le réplicateur) = endroit où la réplication va commencer. Recrutement des acteurs de la réplication : L’hélicase est une enzyme qui va être déposée autour d’un brin d’ADN et qui va hydrolyser les ponts H. Pour cela, elle a besoin d’énergie, elle va donc hydrolyser de l’ATP. La réplication étant bidirectionnelle, on a besoin de 2 hélicases (1 pour chaque fourche de réplication). Une fois les brins d’ADN séparés, ils risquent de se réhybrider. Des prot SSB (single strand binding) ont une affinité leur les simples brins. Elles vont se lier par liaison électrostatique (chargées + qui reconnaissent le squel sucre P -) et des forces d’empilement par superposition des charges électroniques vont les stabiliser. La liaison est coopérative, cad qu’une fois une prot liée, elle va en recruter une autre et ainsi de suite. Le simple brin sera tapissé par ces prot SSB, ce qui va empêcher la reformation d’un double brin. Cette liaison est temporaire. La séparation des brins d’ADN va entrainer en aval de la fourche de réplication un surenroulement du double brin. Ce surenroulement est qualifié de positif. C’est en surenroulement gauche (molécule d’ADN enroulé de pas droit = négatif). Le surenroulement créé en séparant les 2 brins n’est pas idéal. Plus on va progresser, plus le surenroulement va s’aggraver, on risque de ne plus pouvoir séparer les brins. On va utiliser la topoisomérase 2 (= girase chez les procaryotes) qui va provoquer une coupure du double brin de l’ADN (opération dangereuse). Elle se lie au niveau du surenroulement et va couper l’ADN double brin puis elle le relie (activité ligase). Cela va permettre l’inversion du surenroulement → surenroulement + devient – (comme la molécule d’ADN), qui est donc favorable à la séparation du double brin. Une fois les simples brins séparés, la 1ère étape dans la polymérisation de l’ADN est l’ajout d’une amorce qui permettra à l’ADNp de commencer la synthèse. Dans une cellule, c’est une amorce d’ARN (ADN pour un PCR). Une enzyme (primase) va fabriquer de l’ARN àpd d’ADN, elle va synthétiser d’un morceau d’ARN de 5 à 15 nucléotides de manière complémentaire à l’ADN matrice. Ce fragment d’ARN fournit l’extrémité 3’OH dont l’ADNp a besoin pour recopier le brin matrice. La primase va synthétiser l’amorce au niveau du brin précoce au niveau de l’origine de réplication. Après, elle va ajouter des amorces à différents endroits pour le brin tardif. Ajout d’une amorce d’ARN pour permettre à l’ADNp de commencer son travail (elle a besoin d’une extrémité 3’OH). Synthèse d’ADN au niveau de la fourche de réplication : ADNp procaryote : on voit ici la structure de l’holoenzyme (enzyme complète active, avec ses cofacteurs associés pour fonctionner). Elle est constituée des cœurs de polymérases (avec le site catalytique), les bras tau sont des bras flexibles et il y a un complexe lambda qui contient le crampon (slinding cramp) et le chargeur de crampon. Chez les eucaryotes, c’est la même structure mais on a une polymérase delta et une polymérase epsilon. Alors que chez les procaryotes, on a 2 cœurs similaires (polymérase III). Les crampons vont servir à stabiliser l’ADNp sur l’ADN matrice. Ils vont conférer à l’ADNp sa processivité. Le crampon va se placer grâce au chargeur de crampon et stabiliser l’ADNp jusqu’à ce que le complexe rencontre une extrémité ou un ADN double brin déjà répliqué. Elle perd alors son affinité pour l’ADNp et la relargue. L’ADNp n’est pas perdue dans le nucléoplasme, elle reste attachée par la prot tau mais elle est désolidarisée du crampon. Le crampon est un hexamère, comme l’hélicase, et il permet la stabilisation de l’ADNp. Hydrolyse d’ATP pour ouvrir le crampon et le refermer autour de l’ADN. La liaison entre le crampon et l’ADNp saute quand elle rencontre de l’ADN double brin ou quand il y a une perte d’interaction avec d’autres prot que l’on verra après. Si on commence en haut à gauche, on a une polymérisation en cours. On voit que le cœur de polymérase recopie le brin matrice, jusqu’à rencontrer un brin déjà répliqué. Pdt ce temps, l’hélicase sépare le double brin en simple brin, recouvert de prot SSB. Il y a 2 synthèses simultanées, on pourrait même dire 4 car idem dans l’autre direction. La polymérisation de l’ADN se fait tjrs dans le sens 5’3’ du brin en cours de synthèse. L’ADNp va se greffer sur l’amorce. Le brin est synthétisé de manière continue, on parle de brin précoce (leading strand). Une polymérase synthétise le brin opposé et va donc dans le sens 5’3’ de la matrice (mauvais sens) et la fourche de réplication progresse d’un côté. Or les 2 polymérases sont attachées, donc le 2ème brin sera synthétisé de manière discontinue, ce qui va générer un brin tardif (lagging strand). Le brin tardif devra être synthétisé par morceaux (= fragments d’Okasaki). On va ainsi former une boucle : modèle en trombone. Ça permet de plier le brin pour s’assurer que quand la polymérase synthétise ce brin vers la droite ne s’écarte pas du brin précoce. Polymérase qui synthétise de manière continue, pas besoin de pls amorces, alors que synthèse discontinue oui. Il va y avoir des interactions entre l’hélicase et la primase, ou l’hélicase et la polymérase. Ces prot interviennent à différentes étapes concomitantes de la polymérisation de l’ADN. Ce qui va se faire dans l’autre direction est inversé. Brin continu en haut et discontinu en bas Remarque : c’est l’ADN qui glisse dans l’ADNp et non l’inverse dans certaines modèles. Terminaison de la réplication : Chez les procaryotes, CH circulaire. La polymérisation commence à l’origine et se fait de manière bidirectionnelle jusqu’à avoir 2 CH que l’on va devoir séparer grâce à une topoisomérase. La réplication se termine en face de l’origine de réplication, quand les polymérases se retrouvent. Chez les eucaryotes, pour le brin avec polymérisation continue, ça s’arrête quand on arrive au bout. Pour la polymérisation discontinue, la synthèse s’arrête quand le dernier segment d’Okasaki est synthétisé. Il va y avoir un enlèvement des amorces grâce à la RNaseH. Cette endonucléase va couper au niv du 1er ribonucléotide et dégrader l’ARN. Elle va laisser le dernier nucléotide qui sera coupé après par une 5’3’exonucléase. On se retrouve alors avec une brèche, qui va être comblée par une ADNp, qui peut utiliser l’extrémité 3’OH du fragment d’ADN déjà synthétisé. L’ADNp va alors recopier mais elle ne peut pas faire le dernier lien phosphodiester, qui sera fait par une DNA ligase. Au niveau de l’extrémité, la RNase et l’exonucléase vont enlever l’amorce mais le trou libéré ne va pas être rempli car il n’y a pas d’extrémité 3’ en amont pour permettre à l’ADNp de répliquer l’ADN. Ainsi, au niv de l’extrémité 5’, le brin matrice est plus long que le néosynthétisé. Après une nouvelle phase S, le brin matrice sera répliqué de manière normale, le brin matrice sera répliqué aussi de manière normale mais raccourcit sur 1 des brins, le brin gris clair en bas va subir un enlèvement de l’amorce mais le brin qui avait été raccourcit est plus court et sa copie sera donc plus courte. De réplication en réplication, on a donc un raccourcissement des extrémités des CH. Or les télomères (extrémités CH eucaryotes) contiennent des séquences répétées sans gènes, on n’infecte donc pas l’intégrité du génome car on enlève de l’ADN non codant. Mais quand le CH devient trop petit, on touche des gènes importants et la cellule meurt → vieillissement de la cellule par raccourcissement des unités. Chez les bactéries qui ont un CH linéaire, elles utilisent une prot qui va fournir un grpt C-OH qui va permettre à l’ADNp de se positionner et de synthétiser. Cela va permettre la formation d’un lien phosphodiester. Les eucaryotes ont tjrs des CH linéaires, ils ont une enzyme spéciale : télomérase. C’est un complexe ribonucléoprotéique. L’ARN va servir de matrice pour allonger l’extrémité 3’. Elle va venir par complémentarité au niveau du télomère, en porte à faux sur l’extrémité. Elle a une activité polymérase qui va polymériser de l’ADN. Par complémentarité, la télomérase se décroche et se décale d’un cran. Et ainsi de suite. Ce qui va abouti à l’allongement de l’extrémité 3’. Le fait de rallonger l’extrémité 3’ va permettre de synthétiser un fragment d’Okasaki. Ainsi, ce que l’on raccourcit est ce qui a été allongé → peu d’impact sur la longueur du CH. Cpdt, on observe bien un raccourcissement des CH dans la majorité de nos cellules car la télomérase n’est pas exprimée dans la majorité de nos cellules. Elle l’est dans les cellules germinatives, cellules souches et les cellules cancéreuses (caractéristique immortelle car pas de raccourcissement des CH). Si toutes les cellules de notre corps présentaient de la télomérase, on ne saurait plus réguler les cellules → dysfonctionnement de l’organisme.