Principle and Application of Antigen-Antibody Interaction Assays 2022 PDF

MTIB 2022 PRINCIPLE AND APPLICATION OF ANTIGEN-ANTIBODY INTERACTION ASSAYS Terry Anslem Rimpa LEARNING OUTCOME 1. Describe the types and classification of precipitation, agglutination reactions and the agglutination techniques in detections...

MTIB 2022 PRINCIPLE AND APPLICATION OF ANTIGEN-ANTIBODY INTERACTION ASSAYS Terry Anslem Rimpa LEARNING OUTCOME 1. Describe the types and classification of precipitation, agglutination reactions and the agglutination techniques in detections of antigen- antibody interactions. 2. Perform immunology laboratory testing in Antigen-antibody interaction detection Agglutinasi Presipitasi Hemolisis Immunoessei Ujian Hemolisin ELISA Ujian langsung (direct) Ujian Ouchterlony @Double Immunopendaflour immunodiffusion Ujian Tidak langsung Radioimmunoessei (Indirect) Imunoresapan jejarian@ single radial immunodiffusion Ujian Hemagglutinasi Imunoelektroforesis Presipitasi dalam larutan  PRECIPITATION REACTION 1. Precipitation curve 2. Types of Precipitation Reaction Techniques 3. Advantages and Disadvantages of Each Type Techniques 4. Applications of Precipitation Reaction in Clinical Immunology  PRECIPITATION REACTION Prinsip: Tindak balas antara antibodi dan antigen spesifik yang hadir dalam bentuk larut akan meresap dan bertindakbalas dengan menggunakan gel agar sebagai medium Menghasilkan kompleks antigen- antibodi dapat dilihat dalam bentuk garisan presipitasi (mendakan) pada zon optimum  PRECIPITATION CURVE Tindak balas antara antibodi dengan antigen di dalam larutan membentuk mendakan kompleks antigen-antibodi. Pemendakan bergantung kepada kepekatan relatif kedua-dua bahan tindak balas ini. Mendakan paling banyak menunjukkan kadar optimum antigen-antibodi untuk pemendakan.  PRECIPITATION TEST 1. Gel immunodiffusion test: a) single radial immunodiffusion/ Radial Imunoresapan (RID) / Imunoresapan jejarian b) Double radial immunodiffusion Kaedah Ouchterlony Ujian toksisiti Elek’s 2. Imunoelektroforesis (Immunoelectrophoresis) 3. Turbidimetric  SINGLE RADIAL IMMUNODIFFUSION (RID) Antibodi spesifik dicampurkan ke dalam agar sebelum dimasukkan ke dalam piring petri. Antigen dimasukkan ke dalam lubang pada agar. Peresapan antigen bermula dari telaga(well) sehingga mencapai satu titik tempat wujudnya kepekatan optimum untuk pemendakan berlaku. -dilihat dalam bentuk zon garisan cincin (ring)  SINGLE RADIAL IMMUNODIFFUSION Diameter zon akan diukur, diplot pada graf dan dibandingkan dengan nilai standard. Aplikasi: Mengukur kuantiti antibodi @kepekatan antibodi dalam serum (kuantitatif) Ab in gel Ag Ag Ag Ag  DOUBLE RADIAL IMMUNODIFFUSION (OUCHTERLONY METHOD) Teknik digunakan meluas untuk mengesan kewujudan antibodi di dalam serum @ kewujudan antigen di dalam sediaan yang tidak diketahui. Gel agar sebagai medium tindakbalas akan ditebuk dengan beberapa well (lubang) 1 well akan dimasukkan dengan serum pesakit dan sebahagian dimasukkan dengan larutan berantigen Selepas resapan berlaku selama beberapa hari, jalur-jalur presipitin akan terbentuk di tempat antibodi dan antigen bertemu pada kadar yang sesuai (kadar optimum). Aplikasi: Mengesan antibodi atau subkelas-antibodi DOUBLE RADIAL IMMUNODIFFUSION (OUCHTERLONY METHOD)  IMMUNOELECTROPHORESIS  Teknik yang digunakan untuk pemisahan dan pencirian protein berdasarkan elektroforesis dan reaksi dengan antibody  2 tatacara utama yang digunakan adalah elektroforesis dan immunodiffusion  Serum/plasma manusia yang mengandungi protein akan bergerak dan dipisahkan menggunakan elektroforesis  Kemudian antibodi terhadap protein tersebut akan dimasukkan ke dalam well dan meresap ke arah pergerakan protein spesifik  Aplikasi: a) Analisis komponen dalam serum pesakit (kualitatif) b) Mengenalpasti spesifik immunoglobulin (Ab) dalam serum c) Digunakan untuk mengesan protein abnormal dalam kes multiple myloma IMMUNOELECTROPHORESIS PRECIPITATION IN SOLUTION Banyak tiub perlu disediakan dengan pelbagai sediaan nilai kepekatan antibodi dan antigen yang berbeza Bagi mendapatkan garisan presipitasi yang dapat dilihat  TURBIDMETRIC Turbidimetric merupakan cara untuk mengesan dan ujian kuantitatif tindak balas presipitasi dalam serum berasaskan prinsip fenomema sebaran cahaya yang disebabkan oleh presipitasi larutan. PRINSIP: Apabila larutan antigen dicampur dengan antibodi yang spesifik, reaksi berlaku antara antigen dan antibodi membentuk kompleks. Larutan berubah menjadi turbid.  TURBIDMETRIC Turbidimetric berasaskan optical detection system untuk mengukur turbiditi (konsentrasi partikel yang larut dalam larutan). Cahaya (light beam) dihalakan kepada larutan yang diukur. Cahaya dipantulkan bergantung kepada turbiditi larutan. Semakin turbid larutan, semakin banyak sebaran cahaya (scatter). Photodetector mengukur intensiti cahaya yang disebarkan ( scatter light). Semakin turbid larutan, semakin banyak cahaya yang diserap → ABSORBANCE → semakin tinggi kandungan antigen, semakin tinggi absorbance.  TURBIDMETRIC ANTIGEN LARUT= PRECIPITATION ANTIGEN TIDAK LARUT= AGGLUTINATION  AGGLUTINATION REACTION 1. Phases of Agglutination 2. Classification of Agglutination Reaction Techniques 3. Direct and Indirect Antiglobulin Technique 4. Additional Media Used in Agglutination Procedures 5. Applications of Agglutination Reaction in Clinical Immunology  AGGLUTINASI Tindak balas secara spesifik di antara antibodi dan antigen yang dalam bentuk tidak larut menghasilkan kompleks antigen-antibodi yang dapat dilihat dalam bentuk gumpalan (agglutinasi). Jenis-jenis tindak balas agglutinasi 1. Direct agglutination 2. Indirect agglutination 3. Hemaglutinasi (Reaksi aglutinasi melibatkan sel darah merah) Aplikasi: ▪Ujian pengumpulan darah ABO ▪Ujian kehamilan ▪Ujian Widal – mengesan Antibodi terhadap Salmonella ▪Ujian VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) – kesan antibody terhadap Treponema pallidum ▪Ujian Rapid Plasma Reagin (RPR)- kesan antibody terhadap Treponema pallidum  DIRECT AGGLUTINATION Antigen hadir secara semulajadi pada permukaan sel Contohnya antigen atas permukaan bakteria Penggumpalan dapat dilihat dengan makroskopik (mata kasar), jika terdapat tindakbalas spesifik di antara antibodi dengan antigen Aplikasi: Ujian Widal: mengesan demam tifoid & paratifoid Identifikasi strain bakteria seperti Salmonella, Shigella, Vibrio. Ujian Weil Felix  DIRECT AGGLUTINATION Antibodi @ antigen yang diselaputi oleh partikel (contoh: latex, karbon) Aplikasi: Ujian kehamilan latex Ujian VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) – kesan antibody terhadap Treponema pallidum Ujian Rapid Plasma Reagin (RPR)- kesan antibody terhadap Treponema pallidum Identifikasi bakteria cth: Staphylococcus aereus, streptococcus sp Y Y + Y  LATEX PREGNANCY TEST Menguji kehadiran hormon human chronic gonadotrophin (hCG) dalam serum @ urin. PRINSIP: Hormon human chronic gonadotrophin (hCG) hadir di dalam urin dan serum semasa kehamilan Reagent mengandungi antibodi hCG yang diselaputi dengan partikel latex yang bertindak balas secara spesifik terhadap hormon hCG dalam urin dan membentuk aggregasi yang boleh dilihat dengan mata kasar (visible).  LATEX PREGNANCY TEST Tindakbalas antigen-antibodi yang melibatkan sel darah merah sebagai zarah pembawa. Antigen di permukaan SDM diuji dengan antibodi yang spesifik (larutan antisera) Pemerhatian mudah dilihat – kerana SDM yang berwarna merah kelihatan bergumpal Aplikasi: Pengumpulan darah ABO Pendiagnosan penyakit (i.e. infectious mononucleosis) Indentifikasi virus, contoh virus measles  KEPUTUSAN UJIAN TIADA AGGLUTINASI AGGLUTINASI TIADA AGGLUTINASI AGGLUTINASI  KUMPULAN DARAH ABO Penentuan kumpulan darah bergantung kepada kehadiran antigen pada permukaan sel darah merah (SDM).  ASSAYS INVOLVING COMPLEMENT 1. Evaluation of Complement; Functional Assays and Component Assays 2. Complement Fixation Techniques 3. Application of Assays Involving Complement in Clinical Immunology 4. Source of Error in Assays Involving Complement  ASSAYS INVOLVING COMPLEMENT Komplemen merupakan kumpulan protein tidak tahan haba (heat labile) yang boleh dijumpai di dalam darah dan cecair tisu kecuali urin dan CSF. Fiksasi komplemen ialah tindak balas diantara antigen dan antibodi dengan kehadiran komplemen. Fungsi komplemen: Pemusnahan sel @ Ag asing secara lisis melalui laluan terminal (lytic pathway).  HEMOLISIN Prinsip: Sel darah merah akan mengalami hemolisis sekiranya hemolisin hadir. Aplikasi: Ujian penyaringan darah ‘Emergency O’ Ujian pengesanan streptolysin O Anti-streptolysin O (ASO @ ASLO) merupakan antibodi yang dihasilkan terhadap antigen Lancefield group A Streptococci. Wassermann test  HEMOLISIN SISTEM PENUJUK Kebanyakkan tindak balas komplemen dengan kompleks antigen-antibodi tidak menghasilkan sebarang kesan yang dapat dilihat pada molekul antigen. Sistem penunjuk terdiri daripada sel-sel darah merah biri-biri yang diselaputi antibodi antisel darah biri-biri perlu digunakan. (Sheep RBCs coated with their specific antibody) Komplemen mempunyai kemampuan untuk melisis sel-sel yang diselaputi oleh antibodi ini. Keputusan: ○ Reaksi Positif → Tiada Hemolisis ○ Reaksi Negatif → Hemolisis  UJIAN HEMOLISIN Antigen mixed with test serum to be assayed for antibody -standard amount of complement is added -erythrocytes coated with antibody is added -amount of erythrocyte lysis is determined MASALAH YANG DIHADAPI DALAM UJIAN PENGESANAN ANTIGEN- ANTIBODI FENOMENA PROZON - nisbah antibodi lebih daripada antigen FENOMENA POST-ZONE - nisbah antigen lebih daripada antibodi  LABELLED IMMUNOASSAYS 1. Classification of Immunoassays 2. Immunoassay Techniques 3. Application of Immunoassay Technique in Clinical Immunology 4. Interference and source of error in immunoassay technique.  IMMUNOASSAYS Imunoessei merupakan kaedah ujian makmal yang menggunakan antibodi berlabel untuk mengukur kepekatan sesuatu bahan berdasarkan pada tindak balas antigen antibodi membentuk kompleks. JENIS IMMUNOASSAY 1. Enzim immunoassay (EIA) i. Indirect ELISA ii. Sandwich ELISA iii. Competitive ELISA 2. Immunopendaflour i. Direct ii. Indirect 3. Radioimunoassay (RIA)  ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA), ENZYME IMMUNOASSAY (EIA) Prinsip: Tindak balas antigen-antibodi dikesan melalui aktiviti enzim. Kehadiran antigen @ antibodi dikesan melalui antibodi yang dikonjugasi dengan enzim bergabung dengan komplek antigen-antibodi di dalam plate. Substrate kemudiannya ditambah akan ditukarkan oleh enzim dan menujukkan perubahan warna. Digunakan untuk mengesan antigen @ antibodi spesimen pesakit. Menggunakan microtiter plate. ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA), ENZYME IMMUNOASSAY (EIA) Enzim-enzim yang digunakan : Alkaline phosphatase (AP) Horse radish peroxidase Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) Glucose oxidase (GO) Contoh substrate: P-nitrophenyl peroxidase (HRP) O-phenylenediamine  KEGUNAAN ELISA Mengukur aras antibodi (allergi, vaksin) Mengesan antibodi virus (hepatitis, HIV) Mengesan perubahan hormon (kehamilan) KEBAIKAN DAN KEBURUKAN ELISA KEBAIKAN KEBURUKAN Murah Masa yang panjang untuk ujian Spesifik dan sensitiviti yang tinggi dijalankan Tidak memerlukan kelengkapan yang Tidak sesuai digunakan untuk ujian kompleks diagnosis individual Hindari daripada hazard radioaktif. Kuantitatif Kit format Sesuai untuk jumlah ujian yang banyak Sesuai untuk ujian penyaringan JENIS-JENIS IMMUNOASSAY  INDIRECT ELISA Ujian ini digunakan untuk mengesan kehadiran antibodi. Prinsip: Antigen spesifik dilekatkan pada well microtiter plate akan bergabung dengan antibodi dalam serum membentuk komplek Ag-Ab. Antibodi sekunder (Anti Human Ig) yang berlabel enzim ditambah akan bergabung dengan kompleks antigen-antibodi di dalam plate. Substrate kemudiannya ditambah akan ditukarkan oleh enzim dan menunjukkan perubahan warna. Perubahan warna boleh dikesan melalui mata kasar dan kepekatan warna diukur dengan alat pengesan. Aplikasi: Mengesan antibodi HIV, hepatitis Mengesan aras antibodi kes allergi.  INDIRECT ELISA 1. Plate diselaputi dengan antigen. 2. Sampel pesakit ditambah dan dieramkan untuk tindak balas berlaku. Jika terdapat kehadiran antibodi yang dikaji, ia akan bertindak balas dengan antigen membentuk komplek Ag-ab. 3. Plate dibasuh untuk menyingkirkan antibodi yang tidak membentuk kompleks. 4. Antibodi sekunder (anti-human Ig G) berlabel enzim ditambah dan akan bergabung dengan kompleks antigen-antibodi. 5. Plate dibasuh untuk menyingkirkan antibodi berlabel enzim yang tidak bergabung dengan kompleks antigen-antibodi. 6. Substrate ditambah, substrate ditukar oleh enzim dan menunjukkan perubahan warna. 7. Stop solution ditambah dan keputusan dibaca. 8. Keputusan kuantitatif dikesan melalui spektrofotometer @ELISA reader  2. SANDWICH ELISA Assay ini digunakan untuk mengesan kehadiran antigen. Prinsip: Antibodi spesifik dilekatkan pada well microtiter plate akan bergabung dengan antigen dalam spesimen membentuk komplek Ag-Ab. Antibodi yang berlabel enzim ditambah dan bergabung dengan komplek antigen-antibodi di dalam plate. Substrate kemudiannya ditambah akan ditukarkan oleh enzim dan menujukkan perubahan warna. Perubahan warna boleh dikesan melalui mata kasar dan kepekatan warna diukur dengan alat pengesan Aplikasi : Ujian kehamilan Mengesan tumor marker  PROSEDUR SANDWICH ELISA 1. Plate diselaputi (coated) dengan antibodi spesifik. 2. Sampel pesakit ditambah dan dieramkan untuk memberi masa tindak balas berlaku. Jika terdapat kehadiran antigen yang dikaji, ia akan bertindak balas dengan antibodi membentuk kompleks. 3. Plate dibasuh untuk menyingkirkan antigen dalam sampel yang tidak membentuk kompleks. 4. Antibodi sekunder berlabel enzim ditambah dan bergabung dengan kompleks antigen- antibodi. 5. Substrate ditambah dan ditukarkan oleh enzim seterusnya menunjukkan perubahan warna. 6. Tambah stop solution→ keputusan diukur dengan spektrofotometer @ ELISA reader  COMPETITIVE ELISA Assay ini digunakan untuk mengesan kehadiran antigen. Prinsip: Reaksi kompetitif antara antigen (bahan taksiran) dengan antigen coated well untuk bergabung dengan antibodi yang terhad jumlahnya. Aplikasi: Pengesanan free Prostate Specific antigen (PSA)  PROSEDUR COMPETITIVE ELISA 1. Antibodi yang tak berlabel dieram bersama antigen yang spesifik dan membentuk kompleks. 2. Seterusnya ditambah ke dalam antigen coated well. Antibodi yang tidak membentuk kompleks akan bergabung dengan antigen di dalam well. 3. Plate dibasuh untuk menyingkirkan unbound antibody ( lebih banyak antigen di dalam sample, lebih sedikit antibodi yang akan bergabung dengan antigen di dalam well) 4. Antibodi sekunder berlabel enzim yang spesifik terhadap antibodi primer ditambah ke dalam well. 5. Substrate ditambah dan enzim menukarkan substrate dan menunjukkan perubahan warna. 6. Stop solution ditambah dan keputusan diukur dengan spektrofotometer @ ELISA reader 7. Competitive ELISA, semakin tinggi konsentrasi antigen sebenar, semakin pudar signal yang dihasilkan.  IMUNOPENDAFLOUR 1. Direct Fluorescent antibody test 2. Indirect Fluorescent antibody test  IMUNOPENDAFLOUR Prinsip: Imunopendaflour merupakan teknik yang mengunakan antibodi yang berlabel fluorochrome (flourescent dye) untuk mengesan tindak balas antigen antibodi. Apabila kompleks antigen- antibodi terbentuk, akan kelihatan cahaya flourescence di bawah mikroskop flourescence. Fluorochrome yang biasa digunakan: ○ Fluorescein – memancarkan cahaya fluorescence kuning kehijauan. ○ Rhodamine - memancarkan cahaya fluorescence merah. Kegunaannya?? 1. Pendignosan serologi Contoh: Jangkitan bakteria, virus, fungus dan parasite  IMUNOPENDAFLOUR Kebaikan: 1. Ujian yang sensitif 2. Boleh digunakan dalam pelbagai pendiagnosan serologi. Keburukan : 1. Mahal ( setiap antigen memerlukan antibodi yang spesifik) 2. Memerlukan mikroskop fluorescense untuk membaca keputusan ujian.  DIRECT FLUORESCENT ANTIBODY TEST Digunakan untuk mengesan kehadiran antigen. Fluorochrome dilabelkan pada antibodi. Prosedur: 1. Sampel ujian diletakkan (fix) di atas slide. 2. Antibodi spesifik berlabel fluorochrome ditambah pada sampel. 3. Pengeraman dalam tempoh tertentu untuk tindak balas. 4. Slide dibasuh dan diperiksa di bawah mikroskop fluorescence. 5. Keputusan: ○ Antigen hadir → cahaya fluorescence ○ Ag tidak hadir → Tiada cahaya fluorescence Aplikasi: Mengesan bacteria spesifik seperti Streptococcus Group A Mengesan virus dalam sampel seperti virus influenza, Herpes simplex.  INDIRECT IMUNOPENDAFLOUR Digunakan dalam 2 cara: 1. Mengesan antigen dalam sampel pesakit menggunakan antibodi yang diketahui. 2. Mengesan antibodi dalam sampel pesakit menggunakan antigen yang diketahui.  INDIRECT FLUORESCENT ANTIBODY TEST Prosedur Mengesan Antigen 1. Antibodi (reagen) yang diketahui difix pada slide. 2. Serum pesakit ditambah dan dieram untuk tindak balas. 3. Selepas dibasuh, fluorescein labelled anti-human globulin ditambah. 4. Proses pengeraman dan dibasuh untuk membuang lebihan globulin 5. Kompleks Ag-Ab-globulin terbentuk. 6. Pemerhatian dibawah mikroskop fluorescence  INDIRECT FLUORESCENT ANTIBODY TEST Aplikasi: 1. Ujian pengesanan virus rabies 2. Ujian pengesanan Treponema pallidum 3. Ujian Antinuclear antibodies (ANA): mengesan SLE Positive test for rabies Negative test for rabies  RADIOIMUNNOASSAY (RIA) Radioimunnoassay adalah kaedah ujian makmal yang menggunakan radioisotop untuk mengukur kepekatan sesuatu bahan berdasarkan tindak balas antigen-antibodi. Menggunakan gamma counter untuk mengukur paras radioaktif. PRINSIP Berdasarkan persaingan antara antigen berlabel radioisotop dengan antigen tidak berlabel untuk bergabung dengan antibodi yang terhad bilangannya dan membentuk kompleks Ag-ab. Kepekatan radioaktif yang bergabung diukur dengan menggunakan gamma counter.  Isotop yang biasa digunakan: ○ Iodine 125 (125 I)- half life 60 hari, sinar gamma ○ Tritium (3H) – half life 12.3 tahun, sinar beta Iodine 125 paling banyak digunakan contoh dalam penaksiran hormon- hormon: ○ Triidothyrorine (T3) ○ Thyroxine (T4) ○ Follicullar stimulating hormon (FSH) ○ Hormon-hormon peptida (cth: insulin, glucagon) Aplikasi: Kebaikan: Pengesanan dadah seperti Spesifik yang tinggi Sensitiviti yang tinggi Barbiturates, morphine, digoxin. Pengesanan hormon-hormon Keburukan: seperti cortisol, androgen, Kurang stabil estrogen, insulin, TSH & FT4 Hazad radiasi: penggunaan reagent radiolabel Pengesanan allergi. Memerlukan tenaga pekerja yang Pengesanan kanser diperingkat terlatih awal Memerlukan pengurusan yang Ujian penyaringan virus spesifik untuk penyimpanan bahan radioaktif dan pembuangan sisa-sisa hepatitis di tabung darah. radioaktif. Tidak boleh dilakukan untuk jumlah spesimen yang banyak 1. Antigen berlabel (tracer) Sesuatu bahan yang sama seperti mana bahan yang hendak ditaksirkan dan telah dilabelkan dengan bahan radioisotop. 2. Antigen tanpa label Bahan (unknown) yang hendak ditaksirkan didalam contoh ataupun piawai. Selalunya adalah jenis hormon. 3. Antibodi Sejenis immunoglobulin yang akan bertindak balas sama ada dengan antigen berlabel atau antigen tanpa label.  RADIOIMUNNOASSAY (RIA) 1. Sampel pesakit mengandungi antigen tertentu tetapi tidak diketahui kepekatannya akan dieramkan bersama antigen berlabel (trace) yang diketahui kepekatannya. 2. Antiserum yang mengandungi sejumlah antibodi yang terhad juga dimasukkan bersama-sama kedua-dua antigen. 3. Dalam proses pengeraman itu, antigen berlabel akan bersaing dengan antigen tidak berlabel untuk bergabung dengan antibodi. 4. Jika paras antigen tidak berlabel adalah tinggi maka sedikit antigen berlabel dapat bergabung dengan antibodi. 5. Semakin tinggi kepekatan antigen tidak berlabel, semakin sedikit antigen berlabel bergabung dengan antibodi.  Anti- imunuglobulin ditambah untuk presipitasi kompleks antigen- antibodi. Campuran diempar untuk mendapatkan sendimen komplek antigen- antibodi. Antigen dipisah daripada kompleks antigen-antibodi untuk mengukur keradioaktifan antigen berlabel dengan menggunakan mesin pembilang gamma. Kepekatan antigen didalam sampel dapat ditentukan secara membandingkan bilangan antigen berlabel yang bergabung dengan antibodi. PERBEZAAN ANTARA ELISA, IMUNOPENDAFLOUR & RADIOIMUNOESEI ELISA Imunopendaflour Radioimunoesei Kaedah Indirect Direct Competitive Sandwich Indirect Competitive Substrat Perlu Tidak Perlu Tidak Perlu Label Enzim Bahan pendaflour contoh Radioisotop fluorescein Alat pengesan Spektrofotometer Mikroskop UV Mesin pembilang gama Keselamatan Tidak bahaya Tidak bahaya Bahaya (Hazard radioisotop) Masa Lama Cepat berbanding ELISA Sangat cepat Medium tindak Microtiter plate Slaid Microtiter plate balas  ABO grouping (forward and reverse) Urine pregnancy test ( Agglutination / ELISA) Rapid Plasma Reagin (RPR/ VDRL)