Serolojik Yöntemler - Bakteriyel Balık Patojenlerinin Tanımlanması - JAES 2016 PDF

JAES Journal of Anatolian Environmental&Animal Sciences...

JAES Journal of Anatolian Environmental&Animal Sciences Year: 1, No: 3, 2016 (77-82) AÇEH Anadolu Çevre ve Hayvancılık Bilimleri Dergisi Yıl: 1, Sayı:3, 2016 (77-82) Review / Derleme Bakteriyel Balık Patojenlerinin Tanımlanmasında Kullanılan Serolojik Yöntemler Şükrü ÖNALAN1* Mahmut ÇAĞIRGAN2 Muhammed ARABACI 1 Haşmet Çağırgan2 1 Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Su Ürünleri Fakültesi, 65080, Van, Türkiye 2 Ege Üniversitesi, Su Ürünleri Fakültesi, 35040, İzmir, Türkiye Öz: Balık hastalıklarında, bakteri kaynaklı enfeksiyonlar önemli bir yer tutmaktadır. Bakteriyel balık patojenlerini tanımlamak için fenotipik, genotipik ve serotipik yöntemler kullanılabilmektedir. Fakat herbir yöntem için kullanılan farklı metodların iyi bilinmesi gerekmektedir. Bu çalışmada, çeşitli balık hastalıklarının oluşumunda önemli bir role sahip bakteriyel balık patojenlerinin serotipik olarak tanımlanabilmesiiçin uygulanan serolojik yöntemler, balık patojenlerine karşı mücadelede bu yöntemlerin kullanımı ve önemi hakkında bilgi verilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla; kalitatif yöntemlerden presipitasyon, flokülasyon, aglütinasyon ve komplemanfiksasyon testlerine değinilmiştir. Kantitatif yöntemlerden ise türbidimetrik-nefelometrik ölçümler ile immünokimyasal ölçümlerden bahsedilmiştir. Anahtar kelimeler: Balık hastalıkları, patojen bakteriler, serolojik yöntemler Serological Methods Used for Classification of Bacterial Fish Pathogens Abstract: In fish diseases, bacterial originated disease agents are important. To identify of bacterial fish pathogens can be used phenotypic, genotypic and serotypic methods. However, the different methods used for each method need to be well known. In this study, it is aimed at giving information about the serological methods that are required to be classified as the serotypical identification of bacterial fish pathogens which have an important role in occurrence of various fish diseases, using of these methods in struggling against fish pathogens and their importance. For this purpose; qualitative methods such as precipitation, flocculation, agglutination and compliment fixation are explained. In the quantitative methods are mentioned turbidimetric-nephelometric measurements and immunochemical measurements. Keywords: Fish diseases, pathogen bacteria, serological methods GİRİŞ Antijen-antikor arasındaki ilişkiler, organizmaları enfeksiyonlara karşı koruyucu özellik görevini üstlenmelerinin yanı sıra, bakterilerin in Balık yetiştiriciliği, sağlıklı bir besin kaynağı, istihdam veönemli vitro ortamda tanılanmasında da yardımcı olmaktadır. Antijen-antikor bir ihraç ürünü durumuolması nedeniyle, büyük kazanç geliri olan önemli bağlanması ile ilgili in vitro yapılan deneylerde, antikorlar içinde bir sektördür. Türkiye bulunduğu iklim kuşağı ve coğrafi yapısı nedeniyle bulundukları serumlarla kullanıldıkları için bu konudaki reaksiyonlar denizlerde ve iç sularda birçok su ürününün yetiştirilmesi açısından uygun serolojik olaylar olarak bilinmektedir. Serolojik olaylar ile ilgilenen bilim olanaklara sahiptir (Atay ve ark, 2000). dalı ise seroloji olarak isimlendirilmektedir (Erkan ve ark., 2011). Balık hastalıkları, yetiştiricilikte önemli bir sorun Bir antijen molekülünde aynı veya farklı yapıda çok sayıda oluşturmaktadır. Çünkü balıklar, havuz ve kafes gibi kapalı alanlarda epitop bulunabilir. Epitop sayısı molekülün büyüklüğü ve karmaşıklığı ile yetiştirilmekte ve birim alandaki verimliliği yükseltmek için stok yakından ilgilidir. Bu nedenle, bir antijen molekülü birden fazla sayıda yoğunlukları giderek arttırılmaktadır. Bu durum, balıklar için uygun özgüllük gösterebilmekte ve farklı yapıdaki her epitop kendine özgül olmayan yetiştiricilik koşullarının oluşmasına ve buna bağlı olarak da antikorlarla ayrı ayrı birleşebilmektedir. Antijen yüzeyindeki epitop ile enfeksiyonlara karşı hassasiyetin artmasına neden olmaktadır (Sakai, 1999). özgül antikorun bağlanma yeri arasındaki ilişki anahtar ile kilit arasındaki uyuma benzemektedir ve bu iki molekül arasındaki birleşmenin düzeyi Balıklarda bağışıklık temel olarak omurgalılar ile aynı yapıdadır. moleküllerin özelliklerine bağlı olmaktadır. Uyum ve çekim gücü yüksek İmmün yanıttaki başlıca fark tüm fizyolojik sistemlerde olduğu gibi ise moleküller daha hızlı ve sağlam bir biçimde birleşmekte ve çözünmeleri bağışıklık sisteminin sıcaklığa bağlı değişken yapıda olmasından ise çok yavaş olmaktadır (Erkan, 1992). kaynaklanmaktadır. Balıklarda bağışıklık sistemi temel olarak doğal ve kazanılmış bağışıklık olmak üzere iki ana alt grupta sınıflandırılmaktadır Günümüzde serolojik yöntemler viral, bakteriyel, fungal ve (Bly ve ark., 1997). parazit enfeksiyonlarının tanısı amacıyla kullanılmalarının yanı sıra; immünizasyon, immünrekonstitüsyon ve immünsüpresyon sonrası immün Yumurtadan yeni çıkan larva balıkların lenfosit ve antikor kompetansın değerlendirilmesi, immün sistem yetmezliklerinin ya da üretim kapasiteleri sınırlı olmakta, dolayısıyla çevresel antijenlere ve hiperaktivitesinin belirlenmesi, malignansilerin tanısı, transplantasyon hastalıklara karşı dirençleri de düşük olmaktadır (Tatner, 1986). öncesi MHC (Major histo compatibility complex) tespiti ve immünolojik hastalıkların tedavi ve progresyonunun izlenmesi gibi alanlarda 77 Anadolu Çev. ve Hay. Dergisi, Yıl:1, Sayı:3,(77-82) 2016 J.Anatolian Env. and Anim. Sciences, Year:1, No:3,(77-82) 2016 kullanılmaktadır. Serolojik testlerde, mekanizmalarına (aglütinasyon, presipitasyon), uygulama şekline (otomatize, manuel), hızlarına (birkaç saatten birkaç güne kadar) ve kullanım amaçlarına göre (antikor tipi tespiti, kantitasyon vb.) çok sayıda yöntem mevcuttur (Kılıç, 2012). UYGULAMA METODOLOJİSİ Serolojik yöntemler ile bakterilerin sınıflandırılmasında kullanılan bazı immünolojik teknikler, kalitatif ve kantitatif yöntemler olmak üzere başlıca iki şekilde yapılmaktadır. Kalitatif yöntemler; Şekil 3. Tüpte presipitasyon testi ve gözlenen reaksiyonlar (Erkan ve ark., Presipitasyon testleri, Flokülasyon testleri, Aglütinasyon testleri ve 2011). Komplemanfiksasyon testidir. Kantitatif yöntemler ise; Türbidimetrik- nefelometrik ölçümler ve İşaretlenmiş immünokimyasal ölçümlerdir. 1.1.3. İmmünodifüzyon (Jelde Presipitasyon) Testleri: Presipitasyon reaksiyonları antijen ve antikor moleküllerinin birbirine 1. Kalitatif Yöntemler doğru yayılabildiği jel veya yarı katı (Agar Jel) ortamlarda yapılmaktadır. Böyle bir ortamda birbirine doğru yayılan antijen ve antikorun optimal 1.1. PresipitasyonTesti: Presipitasyondan hem enfeksiyon oranda bulundukları bölgelerde karşılaştıklarında bir presipitasyon çizgisi hastalıklarında tanı koymak hem de mikroorganizmaların identifikasyonu veya bandı oluşturarak çökeldiği bildirilmektedir. Jelde presipitasyon işlemi amacıyla yararlanılır (Çağırgan ve ark., 1997).Reaksiyon sonucu kompleks çeşitli şekillerde yapılabildiği rapor edilmiştir (Shepard, 1972). (presipitat) gözle görülür. Reaksiyonda optimum antijen (Ag) ve antikor (Ab) miktarı önemlidir. Ayrıca pH, elektrolit ve ısı da önemli yer teşkil eder 1.1.3.1. Radyal Difüzyon (Tek Yönlü Difüzyon) Testi: Antikor (Kocazeybek, 2012).Bu test solüsyonda ve tüpte yapıldığında presipitasyon içeren antiserumagarla homojen olarak karıştırılmakta ve karışım bir tabaka testi, agar jelde yapıldığında jel presipitasyon testi olarak adlandırılır. halinde lam, plak veya petri kabına konulmaktadır. Katılaşmadan sonra, Antikorlar iki valanslı, antijenler ise çok değerlikli moleküllerdir (Erkan ve agar üzerinde eşit aralıklarla ve aynı çaplara sahip olan küçük çukurlar ark., 2011). açılarak bunların her birine farklı antijen veya bir antijenin çeşitli seyreltileri ilave edilmektedir. Daha sonra; lam, plak veya petri kabı 37 °C’de nemli bir ortamda muhafaza edilmektedir. Süre sonunda, antijen çukurlardan agarın içerisine doğru yayılmakta ve çukurların çevresinde beyaz renkli halka şeklinde bir presipat oluşmaktadır. Çukurların çevresinde daire seklinde beyaz halkanın oluşması pozitif olarak değerlendirilmektedir (Hampton ve ark., 1990). Şekil 4. Radyal difüzyon testi (Shepard, 1972). Şekil 1. Antijen-antikor tepkimesi (Altınışık, 2004). 1.1.3.2. Çift Yönlü Difüzyon (Yayılma) Testi: Bu yöntemde hem antijen hem de antikor molekülleri jel içinde yayılarak (özgüllük varsa) 1.1.1. Tüpte Halka (Ring) Testi: Sıvı ortamda yapılan optimum konsantrasyonlarda karşılaştıkları yerde presipitasyon bandı presipitasyon formudur. Tüpe konulan sabit miktardaki antikor solüsyonu oluştururlar (Kılıç, 2012). üzerine bir tabaka oluşturacak şekilde antijen eklenir. Temas yerinde halka şeklindekipresipatoluşumupozitif olarak kabul edilmektedir(Afonso ve ark., Çözünür antijen ve antikor molekülleri agar plağı üzerinde 2003). açılmış karşı çukurlara konulmaktadır. Antijen ve antikor bu çukurlardan birbirine doğru agar içerisinde yayılırlar ve optimal konsantrasyonlarda karşılaştıklarında bir presipitasyon bandı veya çizgisi oluşmaktadır. Bu testle aynı seruma karşı teste tabi tutulan birçok antijenin birbirine yakınlığı da ortaya konulmaktadır. Plağa dökülmüş agarın ortasında bir ve çevresinde Antijenler birkaç çukur açılır; ortadaki çukura antiserum ve çevredeki çukurlara farklı (çözülebilir) antijenlerin konulduğu rapor edilmiştir(Shepard, 1972). Petri kaplarına dökülen agar (% 0.7-1.5) üzerinde bir kalıp yardımıyla ortada bir adet ve bunun çevresinde ise 0,5-10 mm uzaklıklarda Denklik sıfır: olmak üzere 4-6 adet çukur açılmakta ve çukurların iç kısımları Görünür çökelti boşaltılmaktadır. Ortadaki çukura bilinen bir antiserum veya antijen konulmaktadır. 37°C'de 1-2 gün bekletilen petri kaplarında, gerek ortadaki ve gerekse bunun çevresindeki çukurlarda bulunan moleküller agar içine Antikorlar karşılıklı olarak yayılacakları için antijenle antikorun birleştiği yerlerde beyaz renkli bir çizgi ya da bant meydana gelmektedir(Dijkstra ve De Jager, 1998). Şekil 2. Tüpte halka testi sonucunda gözlenen reaksiyon (Kılıç, 2012). 1.1.2. Tüpte Sulandırma Testi: Optimal antijen-antikor oranını araştırmak için tüpte yapılan en eski yöntemdir. Bir sıra tüpe konulan belli miktarlardaki antikorun üzerine değişen miktarlarda suda çözünür antijen eklemesi yapılır. İlk tüplerde antikor fazlalığı, son tüpte ise antijen fazlalığı vardır.Bulanıklık ve çökelmenin en yüksek düzeydeolduğu tüpte antijen- antikor oranı birbirine eşittir ve bu durum reaksiyona giren moleküllerin titre ve konsantrasyonunu belirlemeye yardımcı olduğu bildirilmektedir Şekil 5. Agarda çift yönlü difüzyon testinde oluşan çizgiler/bantlar (Erkan ve ark., 2011). (Shepard, 1972). 78 Anadolu Çev. ve Hay. Dergisi, Yıl:1, Sayı:3,(77-82) 2016 J.Anatolian Env. and Anim. Sciences, Year:1, No:3,(77-82) 2016 1.1.3.3. İmmunoelektroforez Testi: İmmun difüzyon ve elektroforezin birleştirilmiş tekniğine İmmunoelektroforez denilmektedir. Antijenler elektriksel alanda ayrılmaktadır (elektroforez). Elektroforez için kağıt, selüloz asetat, agar ve poliakrilamid kullanılmaktadır. Antijen molekülleri bu elektrik alanında hareket ederek 7,5 ile 8,6 arasında değişen bir pH derecesinde elektrik yüklerinin farklı olması sebebiyle birbirlerinden ayrılmaktadırlar. Elektroforezden sonra agardan hareket yönüne paralel olacak şekilde bantlar kesilip çıkarılmakta ve bu bantların yerlerine antiserumlar konulmaktadır. Antiserumun yayılması için bir süre beklenmekte ve uygun antijen antikorla karşılaştığında presipitasyon bandı oluşmaktadır (Agrios, 2005). Şekil 8. Laurell (Roket) immünoelektroforez testi (Roseman ve ark., 1987). 1.2. Flokülasyon Yöntemi: Toksin ile antitoksinin uygun miktarlarda karşılaştıklarında meydana getirdikleri kümeciklere flokülasyon denir. Bu kümecikler gözle yada küçük büyütmelerle görünebilmektedir. Toksoid aşıların miktar tayininde kullanılmaktadırlar (Kocazeybek, 2012).Bu testlerde hasta olup olmadığı araştırılacak olan kimsenin kan serumu, sifilize göre özel şekilde hazırlanmış organ ekstreleri ile karıştırılmakta ve flokulasyon yani bir çeşit çökelti meydana gelip gelmediği araştırılmaktadır. Kahn testinde bu esasa göre hazırlanmış Kahn antijeni kullanılmaktadır (Kılıç, 2012). Toksin (antijen) ve antitoksin (antikor) arasındaki reaksiyonla tüpte yaygın bir bulanıklığın meydana geldiği görülmektedir. Flokülasyonda denge bölgesinin çok dar olduğu ve bu bölge dışında prozon ve postzon olayları görüldüğü rapor edilmiştir (Altınışık, 2004). 1.3. Aglütinasyon Yöntemi: Aglütinasyon testleri için, bazı Şekil 6. İmmuno elektroforez testi (Altınışık, 2004). çözünür antijenler inert yapıdaki lateks, polystren veya bentonit gibi partiküler hale getirilmiş taşıyıcı maddeler üzerine bağlanmaktadır. Bazı 1.1.3.3.1. Zıt Yönlü İmmünoelektroforez Testi: Hazırlanıp lama antijenler taze veya formalin ile işlem görmüş eritrosit yüzeyine direkt yayılan agarın iki ucuna iki çukur açılıp çukurların birine antijen, diğerine olarak bağlanabilmektedir. Sıvı ortamda karıştırılan partiküler yapıdaki antiserum konulmaktadır. Antikorun bulunduğu taraf pozitif kutba, antijen ile özgül antikorun (aglütinan antikor) homojen görünümü zamanla antijenin bulunduğu taraf ise negatif kutba bağlanılmaktadır. Negatif yüklü çıplak gözle görünebilen kümeleşme haline dönüşmektedir. Partiküler olan antijen antiseruma doğru, antikor ise elektroendozmozla antijene doğru antijen olarak eritrositin kullanıldığı aglütinasyon testlerine hareket eder ve karşılaştıkları yerde bir presipitasyon bandı oluştuğu rapor hemaglütinasyon testleri denilmektedir. Aglütinasyon testleri mikroskopta, edilmiştir (Erkan ve ark., 2011). tüpte, lamda yapılabilmektedir. Aglütinan antikorlar genel olarak IgM ve IgG karakterinde olduğu bildirilmiştir (Güngör ve ark., 2014). 1.1.3.3.2. Laurell (Roket) İmmünoelektroforez Testi: Roket elektroforezi de denilen bu yöntemde, daha çok “titresi bilinmeyen bir antijenin titresini, titresi bilinen aynı türdeki bir antijen ile karşılaştırarak ölçmek”olarak açıklanmaktadır (Kılıç, 2012). Ortama elektriksel akım uygulandığında, rokete benzer şekilde presipitasyon bantları oluşmaktadır. Meydana gelen presipitasyon bantlarının yüksekliği eklenen antijen konsantrasyonu ile doğru orantılıdır (Erkan, 2011). Şekil 9. Flokülasyon yöntemi (Altınışık, 2004) 1.3.1. Lateks Aglütinasyon (LA) Testi: Lateks aglütinasyon testinde partiküler antijen olarak lateks boncuklar, lam ve özel kartekslerkullanılmaktadır. Lateks yüzeyi, antijen araştırılacaksa antikor molekülleri ile, antikor araştırılacaksa antijen molekülleri ile kaplanılmaktadır. Pozitif reaksiyonun değerlendirilmesi kümeleşmenin şiddetine göre derecelendirilmektedir. LA testi ile alınan sonuçlar kullanılan lateks partikülünün boyutuna, kullanılan antikorların avidite ve Şekil 7. Zıt yönlü immünoelektroforez testi (Altınışık, 2004). affinitesine (monoklonal veya poliklonal), sıcaklık, pH, iyon konsantrasyonu ve örnekteki antijen konsantrasyonu gibi değişkenlere bağlı olarak gerçekleşmektedir (Barnes ve ark., 2002). Bu test için her çalışmada mutlaka pozitif ve negatif kontrol kullanılması gerekmektedir. 79 Anadolu Çev. ve Hay. Dergisi, Yıl:1, Sayı:3,(77-82) 2016 J.Anatolian Env. and Anim. Sciences, Year:1, No:3,(77-82) 2016 1.3.3.2. İndirekt (Pasif) Hemaglütinasyon Testi; Bu yöntem antikor saptanmasında kullanılır ve 96 çukurlu ‘U’ tabanlı mikropleytlerde gerçekleştirilmektedir. Çeşitli antijenler (bakteriyel, viral, fungal, paraziter), kimyasal maddeler kullanılarak (örn: tannik asit) eritrosit (genellikle koyun eritrositi) yüzeyine bağlanması sağlanmıştır (duyarlılaştırma). Pozitiflik olduğunda hemaglütinasyon, negatiflik varsa düğme gibi çökme görülmektedir. Bu yöntem laboratuvarda sifilizserolojisinde (TPHA testi) ve amip ve ekinokok antikorlarının araştırılmasında kullanılmaktadır (Usta ve ark., 2005). 1.4. Kompleman Fiksasyon Testi: Bu teknik balık bakteriyolojisinden ziyade balık virolojisi için daha önemli yer teşkil Şekil 10. Lateks aglütinasyon test sonucu görüntüsü (Çolak, 2004). etmektedir.Bu teknik Ahne tarafından 1981 yılında tanımlanmıştır (Austin ve Austin, 1999). 1.3.2. Koaglütinasyon (CoA) Testi: Bu yöntemde partikül olarak öldürülmüş Staphylococcusaureusbakterisi kullanılmaktadır. Bu bakterinin Antijen-antikor birleşmesinin komplemanı uyarmasına hücre duvarında bulunan ‘Protein A’ maddesi büyük miktarda antikor dayanarak geliştirilen iki basamaklı testtir. Serum dilüsyonu yapılmış bağlama özelliği taşımaktadır. Stafilokokların yüzeyine istenilen özgüllükte tüplerin her birine eşit miktarda antijen eklenir. Eklenen antijenle serum antikor molekülü Fab (antijen bağlama) bölgeleri serbest olacak şekilde Fc örneğindeki antikor (var ise) birleşerek immün kompleks oluşur. Tüplerde kısmından bağlanır ve LA testinin aksine bu yöntem sadece antijen antijen-antikor kompleksi aracılığı ile tüketilmemiş kompleman kalmış ise tespitinde kullanılabilmektedir. Özgüllüğü yüksek olmasına rağmen kalan aktif kompleman miktarı ile ilişkili olarak indikatör hücrelerin duyarlılığı LA testine göre düşük olduğundan örnekten direk antijen tamamında veya bir kısmında hemolizgörülür. Hemoliz olan ilk tüpten bir tespitinde önerilmediği bildirilmiştir (Günaydın, M.,1994). önceki tüpteki serum titrasyonu antikor miktarını tanımlamak için kullanılır (Darwish, 2006). 1.3.3. Hemaglütinasyon Testi: 1.3.3.1. Direkt Hemaglütinasyon Testi; Bu yöntem, bazı enfeksiyonlarda eritrosit yüzeyindeki antijenlere karşı doğal olarak oluşan antikorların tespitinde kullanılmaktadır. Bu testler hızlı tanı için yararlı olmalarına rağmen özgüllük ve duyarlılıkları düşük olduğu rapor edilmiştir (Kılıç, 2012). Şekil 11. Aglütinasyon yöntemi (Altınışık, 2004). Şekil 12. Komplemanfiksasyon testi (Altınışık, 2004). 80 Anadolu Çev. ve Hay. Dergisi, Yıl:1, Sayı:3,(77-82) 2016 J.Anatolian Env. and Anim. Sciences, Year:1, No:3,(77-82) 2016 2. Kantitatif Yöntemler SONUÇ 2.1. Türbidimetrik ve Nefelometrik Ölçümler: Bu yöntemler, Bu çalışmada balıklarda enfeksiyona neden olan bakteriyel sıvı ortam içinde karşılaştırılan ve birleşerek bulanıklık oluşturan antikor- patojenlerin serolojik olarak değerlendirilebilmesi için kullanılabilecek antijen komplekslerinin içinden geçen ışık şiddetine göre kantitatif olarak serolojik yöntemlere değinilmiştir. Serolojik yöntemler balık hastalıklarında ölçüldüğü otomatize yöntemlerdir. Genel olarak kompetitif veya koruyucu müdahaleler kapsamında önemli bir yere sahiptir. Günümüzde nonkompetitifve heterojenveya homojenolarak sınıflandırılmaktadır. serolojik çalışmalar hızlı teşhis, enfeksiyon ve bağışıklık hakkında fikir Kompetitif reaksiyonlar, genellikle işaretlenmiş antijen kullanılmakta ve edinme, izolatkarakterizasyonu ve aşı geliştirme gibi konularda aşırı antijen varlığında antijen ölçümü için yapılmaktadır. Nonkompetitif kullanılmaktadır. ölçümler, genellikle işaretlenmiş bir antikor kullanılarak ve aşırı antikor varlığında antijen ölçümü için yapılmaktadır(Kılıç, 2012). Kalitatif sonuçlar Cut-off değerine göre pozitif/negatif olarak değerlendirilmektedir. Genelde Ag, bazen IgM varlığının belirlenmesinde 2.2. İşaretlenmiş İmmüno kimyasal Ölçümler: İşaretli değerlidir. IgG düzeyi ve takibinde işe yaramadığı bildirilmiştir. Kantitatif antikorların kullanılması ile 1942’de FA (Florasan Antikor-Fluorokromlar), sonuçlarda ise konsantrasyonu bilinen standart serumlar kullanılmaktadır. 1954’de IFA (İndirekt Fluoresan Antikor), 1960’da RIA (Radyoizotopla- İyotla) ve 1970’de EIA veya ELIZA (Enzim ile antikor veya antijen Serolojik yöntemlerin duyarlılıkları arasında farklılıklar olduğu saptamak) yöntemleri kullanılmaya başlanmıştır (Usta ve ark., 2005). belirtilmekte ve gerektiğinde bu yöntemlerin diğer tanı yöntemleri ile birlikte kullanılması önerilmektedir. Serolojik yöntemlerin duyarlılıklarına 2.2.1. Radioimmunoassay (RIA): Radioimmunoassay ilişkin bilgiler şekil 13‘de verilmektedir. yönteminin tarihi ve geliştirilmesi Najjar ve Weintraub tarafından incelenmiştir. RIA yöntemi biyolojik akışkanlar içinde farmasötik açıdan Tablo 1. Serolojik yöntemlerin duyarlı oldukları aralıklar (Dijkstra ve De önemli bileşiklerin sınırsız sayıda belirlenmesi için başarılı bir şekilde Jager, 1998). kullanılmıştır (Darwish, 2006). Yöntem Adı Tanılama Aralıgı (μg/ml)* Presipitasyon Testleri (Sıvı) 20-200 Radyoimmunoassay’de temel mekanizma, radyo izotop bir Presipitasyon Testleri (Jel) madde ile işaretli antijen veya antikor aracılığı ile karşılığı olan (özgül - Radial İmmuno diffüzyon 10-50 - Çift Yönlü İmmuno diffüzyon 20-200 olduğu) antikor veya antijenin varlığını ve miktarını saptamaktır. En fazla - İmmuno elektroforez 20-200 kullanılan madde radyoaktif iyottur. Standart grafikler kullanılarak İmmuno fluorescence Assay (IFA) 1-8 reaksiyona giren moleküllerin miktarları tayin edilmektedir (Erkan ve ark., Aglütinasyon Testleri 0,3-0,06 2011). Radio immuno assay (RIA) 0,0006-0,006 Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) < 0,0001-0,008 2.2.2. Enzyme İmmunoassay (EIA-ELIZA): Antijen-antikor *Antijenin varlığında pozitif reaksiyonun oluşması için gerekli olan en etkileşimlerine dayanarak birbirleri arasındaki farklılıklarının ortaya düşük antikor miktarları konulması için serolojik yöntemler içerisinde en duyarlı ve hassas yöntem olarak Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) kullanılmaktadır Bu çalışmada bahsi geçen serolojik yöntemler içerisinde ELISA (Önalan ve Arabacı, 2016). testi, kullanılan konjugatlardan Alkalin Fosfataz ve Horse Radish Peroksidaz (HRP) enzimlerinin; ucuz, kolay olması ve fazla çeşitte substrat Enzim İmmünoassay yapışacak kimyasalın bir radyoizotop olarak kullanılabilmesi sebebiyle tercih edildiği bildirilmiştir (Çağırgan, yerine bir enzim olması ile RadioimmunAssay(RIA) ‘den ayrılmaktadır 2008). (Darwish, 2006). Serolojik yöntemlerin dezavantajları; tür içindeki farklı izolatlar Beliren renkli reaksiyon ürünlerinin miktarı enzim işaretli arasındaki çapraz reaksiyon oluşumuve antijenler için uygun antiserum reaktiflerin ve dolayısıyla katı faza bağlanan Ag ve Ab’nin miktarını bulunması veya elde edilmesindeki zorluklardır (Diler ve ark., 2002). belirlemektedir (Kılıç, 2012). ELISA ile antijen ve antikor araması yapmak ve bunların miktarlarını saptamak mümkün olmaktadır. Testte; özgül Avantajlı olan yönleri ise; belli bir etkene özgül olan reaksiyon antijen-antikor ilişkisi, bu komplekse eklenen antikorlara alkalin fosfataz vermesi, az miktarda enfekte olmuş doku materyaline ve antiseruma gerek veya Horse Radish Peroksidaz gibi bir enzimin bağlanması ve bu enzim duyulması, rutin testlerde kullanılabilmesi, sonuçların kısa sürede ve substratının renkli ürünlere dönüştürülmesi suretiyle gösterilmesi esas kantitatif olarak elde edilebilmesi, testlerde yararlanılan tanı kitlerinin ticari alınmakta ve sonuçlar kolorimetrik olarak değerlendirilmektedir. olarak piyasada bulunması ve maliyetlerinin düşük olması olarak sıralanabilir (Yula, 2009). Ortama sonradan katılan, antijene karşı oluşturulmuş ve enzimle bağlanmış spesifik antikor da, bu kompleksteki antijene bağlanmaktadır. En Buna rağmen, son yıllarda geliştirilen ve nükleik asit temelli son katılan kromojensubstrat, komplekste var olan enzimle reaksiyona olan yöntemlerin serolojik yöntemlerle birlikte kullanılması, inceleme girerek renk vermekte ve kolorimetrik olarak değerlendirme yapılmaktadır konusunu teşkil eden patojenlerin doğru ve kesin olarak teşhis ve tanısını (Dijkstra ve De Jager, 1998). yapabilmek için uygulamalarda yerini almaya başlamıştır. Bununla birlikte; çalışmalarda kullanılacak olan yöntemin seçiminin eldeki kaynaklara, testi 2.2.3. Fluoroimmunoassay (FIA): Bu testte, antikorlar yürütenin bilgi ve deneyimine, uygulamanın yapılacağı laboratuarın fluorokrom bir boya (FITC= fluoresceinisothiocyanate, auramine, koşullarına, testler için gerekli olan reaktiflerin durumuna, testin duyarlılık rhodamin, vs) ile boyanmaktadır. Test örneğinde bulunan antijenin üzerine düzeyine ve süresine, test edilecek örneğin durumuna, çeşidine ve miktarına boyalı antikorların konulması halinde, boyalı antikorlar antijenle bağlı olduğunu göz önünde tutmak yararlı olacaktır (Dijkstra ve De Jager, birleşmekte ve UV-ışınları ile çalışan mikroskopta sarı-yeşil renkte parlak 1998). Moleküler tipleme sonuçlarının da en faydalı biçimde sonuçlarından bir fluoresens ışık vererek kolaylıkla fark edilebilmektedirler. Time- yararlanılması için klasik yöntemler ile birlikte değerlendirilmesi Resolved Fluorescence Immunoassay ve Fluorescence Polarization gerekmektedir. Immunoassay (FPIA) gibi çeşitli fluoroimmunoassay yöntemler vardır (Dijkstra ve De Jager, 1998). KAYNAKLAR Afonso, A., Silva, J. ve Gomes, S., (2003). Lactococcus garvieae trout ınfections in portugal: A new challenge on fish vaccinology. IBMC News, February, 4–6. Agrios, G.N., (2005).PlantPathology “5th Edition”. ElsevierAcad. Press, U.S.A., XXV+922 p. Altınışık, M., (2004). İmmünolojik teknikler. ADÜTF biyokimya A.D., http://www.mustafaaltinisik.org.uk /45-uzm-03.pdf. Austin, B. and Austin, D.A., (1999). Bacterial fish pathogens: disease of Şekil 13. İmmünofluorescence tipleri ve elde edilen görüntüler (Dijkstra ve farmed and wild fish. Third (Revised) edition, Springer. Praxis De Jager, 1998). Publishing Ltd, Chichester, UK, 166-173. p. Barnes, A.C., Guyot, C, Hansen, B.G., Mackenzie, K., Home, M.T. and ElHs, A.E. (2002). Resistance to serum killing may contribute to differences in the abihties of capsulate and non-capsulated 81 Anadolu Çev. ve Hay. Dergisi, Yıl:1, Sayı:3,(77-82) 2016 J.Anatolian Env. and Anim. Sciences, Year:1, No:3,(77-82) 2016 isolates of Lactococcus garvieae to cause disease in rainbow Kocazeybek, B., (2012). İmmünolojik tanı yöntemleri, Erişim tarihi: trout (Oncorhynchus mykiss L.). Fish&Shell fish Immunology, 22.03.2014. http://www.ctf.edu.tr/index.php?option=com 12, 155-168. content&view=article&id=272&Itemid=110&jsmallfib=1&dir=J Bly, J.E., Quiniov, S.M.-A and Clem,L.W., (1997). Environmentel effects SROOT%5Cbekir-kocazeybek/ders-otlari/TIP+2-+7-2 2012 & on fishimmun emechanisms. Dev. Biol. Stand. 90, 33-49. download_file=JSROOT%5Cbekir-kocazeybek/ders-notlari Çağırgan, H., (2008). İnfeksiyöz pankreatik nekrozis hastalığının teşhisi /TIP+2-+7-2-2012/1-İmmunoloji+Tanı+Yöntemleri için enzyme linked immunosorbent assay geliştirilmesi. Bornova +05.03.2013. ppt. Vet. Kont. Araşt. Enst. Derg., 30 (44): 15-22. Önalan, Ş., ve Arabacı, M., (2016). Van, Bitlis, Muş ve Hakkari illerinde Çağırgan, H., Tanrıkul, T.T. and Balta, F., (1997). Characteristics of bulunan gökkuşağı alabalığı çiftliklerinden elde edilen yellow pigmented bacteria isolated from diseased rainbow trout Lactococcus garvieae izolatlarının fenotipik, serotipik ve (Oncorhyncus mykiss). Eighth international conference. genotipik farklılıklarının belirlenmesi. Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Diaseases of fish and shell fish 14-19 Sep. 1997. Edinburg, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi. Scotland european association of fish pathologists. Roseman, S., Meadow, N. D.,, Revuelta, R., Chen, V. N., andColwell, R. Çolak, D., (2004). Hızlı viral tanı testleri. Akdeniz Üniversitesi, Tıbbi R., (1987). Phosphoenolpyruvate: Glycose phosphotransferase mikrobiyoloji anabilim dalı, Viroloji bilim dalı. system in species of vibrio, A widely distributed marine http://slideplayer.biz.tr/slide/2860053/. bacterial genus. journal of bacteriology, Nov. 1987, Vol. 169, Darwish, İ. A., (2006). Immunoassay methods and their applications in No. 11. P. 4893–4900 0021-9193/87/114893-08$02.00/0. pharmaceutical analiysis: Basic methodology and recent Shepard, J.F., (1972). Gel-diffusion methods for the serological detection advances. İnternational Journey of Biomedical Science, 2 (3): of potato viruses X, S and M. Montana Agric. Exp. Station, 217-235. Montana State University, Bulletin No: 662, 72 p. Dijkstra, J. and De Jager, C.P., (1998). Practical plant virology-protocols Tatner, M.F., (1986). The Ontogeny of humoral immunity in rainbow trout and exercises. Springer - Verlag, Berlin, Germany, XVI+459 p. (Salmo gairdneri). Veterinary Immunology and Diler, O., Altun, S., Adiloglu, A.K., Kubilay, A. ve Işıklı, B., (2002). Immunopathology, 12, 93-105. First occurrence of Streptococcosis affecting farmed rainbow Usta, M., Sipahioğlu, H.M., ve Polat, B., (2005). Comparison of DAS- trout (Oncorhynchus mykiss) in Turkey. Bull. Eur. Ass. Fish ELISA and RT-PCR methods for detection of prunus necrotic Pathol., 22, 21–25. ringspot virus (PNRSV). Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Ziraat Erkan, S., Gümüş, M., Paylan, İ.C., Sipahioğlu, H.M., (2011). Bitki Fakültesi, Tarım Bilimleri Dergisi, 15 (2): 153-158. virüslerinin tanılanmasında kullanılan serolojik yöntemler Yula, E., (2009). Fenotipik ve genotipik tiplendirme yöntemleri. Çukurova Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi, 9 (2): 35-49. Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, 23-25 Erkan., S., (1992). Moleküler biyoloji. Doğruluk matbaacılık Ltd. Şti., Mart 2009. http://www.klinikmikrobiyoloji.com Bornova, İzmir, 140s. /indir/fenotipikvegenotipik.pdf Erişim Trh:08.05.2013 saat: Hampton, R., Ball, E. And Boer, S. D., (1990). Serological methods for 23:09. detection and identification of viral and bacterial plant pathogens: A laboratory manual. APS Press, Minnesota, U.S.A., 389 p. Günaydın, M., (1994). Bakteriyel menenjitlerin laboratuvar tanısı. ANKEM Geliş tarihi: 11.11.2016 Derg., 8 (3): 291-294. Kabul tarihi: 01.12.2016 Güngör, S., Gökmen, A.A., Uzun, B., Er, H.H., Pektaş, B., ve Kilimcioğlu, A.A., (2014). Bir üçüncü basamak hastanede Toxoplasma gondii IgG avidite test istem ve sonuçların *Başlıca Yazar Yazışma adresi: değerlendirilmesi. Journal of clinical and experimental Dr. Şükrü ÖNALAN investigations, 5 (2): 246-249. Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Su Ürünleri Fakültesi, 65080, Van, Türkiye Kılıç, İ. H., (2012). Serolojik Tanı Yöntemleri, http://www1.gantep.edu.tr E-mail: [email protected] /~ikilic/wp-content/uploads/2012/12/6imnl.pptx 82