Micro-organismes in de klassieke biotechnologie PDF

1 Micro-organismen in de klassieke biotechnologie LEERDOELEN Bij het bestuderen van dit deel tracht je volgende leerdoelen te bereiken: ❑ Een algemeen idee krijgen van de opbouw van micro-organismen ❑ Beseffen dat micro-organismen alom vertegenwoordigd zijn ❑ De betekenis van micro-organismen kunnen...

1 Micro-organismen in de klassieke biotechnologie LEERDOELEN Bij het bestuderen van dit deel tracht je volgende leerdoelen te bereiken: ❑ Een algemeen idee krijgen van de opbouw van micro-organismen ❑ Beseffen dat micro-organismen alom vertegenwoordigd zijn ❑ De betekenis van micro-organismen kunnen schetsen in onze leefwereld aan de hand van voorbeelden en toepassingen 1.1 Indeling in de levende wereld Van oudsher heeft men de organismen ingedeeld in een plantaardig en een dierlijk rijk. Maar er is een grote groep van organismen, de eencelligen, die vormen kennen waarvan moeilijk is uit te maken of ze nu plant of dier zijn. Dit gegeven was voor de Duitse zoöloog Haeckel aanleiding om een derde rijk voor te stellen, het rijk der Protista. Toch zijn er nog twee groepen die zich moeilijk bij één van de drie genoemde groepen laten indelen. Allereerst zijn er de bacteriën en cyanobacteriën (blauwwieren), die zich van de andere Protista onderscheiden door het feit dat ze prokaryotisch zijn. Verder zijn er de zwammen en schimmels, die zich van planten onderscheiden door hun bouw (geen vaten) en hun energievoorziening (geen fotosynthese) en die zich van dieren onderscheiden door hun wijze van spijsvertering (geen ingestie). Om deze en andere redenen hebben biologen zoals Whittaker besloten een vijf-rijkensysteem op te stellen (zie Figuur 1): • Monera: alle prokaryoten (bacteriën en cyanobacteriën) • Protista: de eukaryotisch-eencelligen (protofyten, protozoa en protomyceten) • Fungi: zwammen en schimmels • Plantae: hogere wieren, sporenplanten en zaadplanten • Animalia: dieren met ingestie Soms worden de Protista niet als apart rijk aangeduid, maar worden deze eukaryoten verdeeld over de drie andere rijken, naargelang hun verwantschap. Het verschil tussen een vijf-rijkensysteem en een vier-rijkensysteem is overigens meer een kwestie van accent. De stippellijn in Figuur 1 kan dus op twee manieren worden uitgelegd, als de grens van een rijk of als een geleidelijke overgang van eencelligen naar meercelligen. AB – Biotechnologie & Microbiologie 10 Figuur 1 Indeling van het levend rijk De microbiologie is een discipline die zich bezighoudt met de studie van deze organismen die microscopische afmetingen hebben (kleiner dan 1/100 mm of ongeveer 10 µm) zodat ze met het blote oog niet meer waar te nemen zijn. Tot de micro-organismen kunnen worden gerekend: bacteriën, protozoën, algen, virussen (waaronder virussen die pathogeen zijn voor bacteriën, de zogenaamde bacteriofagen) en schimmels (waaronder de lagere schimmels zoals gisten). Ook de macroscopische paddenstoelen worden tot de micro-organismen gerekend. Deze paddenstoelen zijn namelijk de vruchtlichamen van de ondergrondse micro-organismen. AB – Biotechnologie & Microbiologie 11 1.2 Bacteriën 1.2.1 Inleiding In de huidige systematiek en classificatie van organismen worden de bacteriën als een- of meercellige organismen bij de groep van de Monera of Prokaryota gerangschikt omwille van het ontbreken van een kernomhulsel en de typische mitosedelingsfiguren waarin duidelijk chromosomen kunnen waargenomen worden. Bacteriën zijn in zeer verschillende milieus te vinden. Ze leven zowel in vochtige grond als op glaswanden van broeikassen als in zoet en zeewater. Het zijn vrijwel de enige organismen die in warmwaterbronnen (IJsland, Japan en de Verenigde Staten), bij temperaturen hoger dan 70°C kunnen overleven. Van die eigenschap wordt gretig gebruik gemaakt in de biotechnologie en onderzoeksmethoden van DNA. Deze organismen worden beschouwd als de meest primitieve levende wezens op aarde. 1.2.2 Morfologie 1.2.2.1 Vorm Bacteriën worden meestal naar hun celvorm ingedeeld. Figuur 2 geeft een overzicht van mogelijk vormen en de groeperingen die daaraan gelinkt zijn. Figuur 2 Celvormen en groeperingen bij bacteriën AB – Biotechnologie & Microbiologie 12 Kokken zijn bolvormig. Na een celdeling kunnen de dochtercellen van sommige soorten bij elkaar blijven, waardoor typische patronen ontstaan. Zo vormt de verwekker van longontsteking Pneumococcus meestal dubbele cellen (diplokokken). Vaak vormen cellen van kokken lange ketens (streptokokken) of een soort trosjes (stafylokokken). Maar elke cel hieruit staat apart. Op grond van de ruimtelijke rangschikking van de afzonderlijke kokken spreekt men van (enkele voorbeelden in Figuur 3): • Microkok: cellen onafhankelijk van elkaar • Diplokok: cellen in paren en dikwijls omgeven door een slijmkapsel • Stafylokok: delingen in twee dimensies; de kokken blijven samenhangen in druiventrosachtige conglomeraten • Streptokok: cellen in ketentjes • Sarcina: delingen in drie dimensies, waardoor pakketjes ontstaan Figuur 3 Enkele typische patronen van kokken met de scanning elektronenmicroscoop: A: Streptococcus salivarius uit de mond (x 12.600); B: Staphylococcus aureus uit de neusholte (x 6230) Bacillen zijn naar vorm afgeronde cilindertjes of staafjes (Figuur 4), die dikwijls een snoer vormen (streptobacillen). Vibrio cholerae, de verwekker van cholera, is een sterk gebogen of kommavormig staafje, Rhizobium sp. en Azotobacter sp. zijn bodemsoorten die stikstofgas uit de lucht kunnen verwerken. Figuur 4 Een scanning-elektronenmicroscopische opname (x 4100) van de staafvormige bacterie Rochalimaea quintana AB – Biotechnologie & Microbiologie 13 Spirillen hebben de vorm van een spiraal (Figuur 5). Figuur 5 Een opname (x 2995) van de spiraalvormige bacterie Spirillum volutans Spirocheten zijn spiraalvormige bacteriën met een flexibele celwand. 1.2.2.2 Afmetingen De meeste bacteriën zijn veel kleiner dan een enkele cel uit een meercellige plant of een dier. Waar de grootste bacterie een diameter van 5 µm heeft, meten de kleinste nauwelijks 0,2 µm. Gemiddeld situeert de diameter zich rond de 1 µm. Dat betekent dat ze met de lichtmicroscoop slechts als stipjes te zien zijn. Detailstudie vergt dan ook het gebruik van een elektronenmicroscoop. Nochtans bevestigen ook hier de uitzonderingen de regel want in Namibië werd er door een Duitse biologe een reuzenbacterie (Thiomargarita namibiensis) ontdekt die een paar duizend keer groter is dan de gemiddelde bacterie. Ze heeft een diameter van bijna 0,75 mm. Het is een zwavelbacterie die voorkomt in de modder voor de Namibische kust. De ronde cellen worden als een parelsnoer bij elkaar gehouden door een slijmschede. De diameter van bolvormige bacteriën (kokken) bedraagt meestal ca. 0,5 µm. Er zijn echter ook grotere kokken, zoals Sarcina ventriculi, die 2,5 µm meet. Staafvormige bacteriën kunnen zeer lang en dun, maar ook zeer kort en dik tot ellipsvormig zijn. Bij Escherichia coli bijvoorbeeld bedraagt de lengte 1-3 µm bij een diameter van 0,5 µm, een lang staafje als Bacillus anthracis meet 3-10 µm bij 1-1,3 µm. 1.2.2.3 Kapsels en flagellen Vaak zijn de cellen van bacteriën nog bedekt met een laag buiten om de celwand heen. Dit zijn de kapsels of slijmlagen. Deze bestaan uit polymeren van diverse samenstellingen. Deze kapsels zijn niet zonder betekenis. Stammen van Streptococcus pneumoniae die een kapsel AB – Biotechnologie & Microbiologie 14 bezitten (S-vorm, van "smooth") zijn pathogeen voor de mens, terwijl kapselloze stammen (R-vorm van "rough") niet pathogeen zijn. Zeer veel bacteriën kunnen zich voortbewegen met behulp van flagellen. Dit zijn zweepharen die op verschillende plaatsen aan de cel vast kunnen zitten. Ze bestaan uit lange in elkaar gedraaide strengen eiwit, het eiwit wordt flagelline genoemd en vertoont overeenkomst met het myosine van de spieren. Het bezit van flagella en ook de plaats waar ze zich bevinden, dienen vaak als identificatiekenmerk van bacteriesoorten. Bij staafvormige bacteriën kunnen zij polair (aan het einde) en/of lateraal (aan de lange zijde) aan de cel vastzitten. Bezitten de bacteriën slechts één dikke flagellum, dan spreekt men van monotrich, bij meerdere flagella spreekt men van polytrich. 1.2.2.4 Sporen Tot slot komen in een relatief kleine groep bacteriën endosporen voor (zo genoemd omdat zij zich intracellulair of in de cel bevinden, zie Figuur 6). Deze behoren bijna allemaal tot de familie der Bacillaceae en Clostridiaceae, waartoe respectievelijk de geslachten Bacillus en Clostridium behoren. Ze zijn in staat om per bacterie één spore te vormen, in tegenstelling tot de sporen bij onder andere schimmels hebben deze endosporen geen vermeerderingsfunctie. Deze endosporen zijn goed bestand tegen ongunstige omstandigheden, ook tegen droogte, desinfectantia en warmte. Endosporen kunnen 100°C overleven, maar worden vernietigd in een autoclaaf (bij 120°C gedurende 20 minuten). Miltvuur- en tetanus-sporen kunnen jaren lang in de grond levensvatbaar blijven. Zodra de sporen weer in een gunstigere omgeving komen, groeit uit elke spore een bacterie. Gezien de grote hitte- en droogteresistentie van deze sporen is het duidelijk dat ze een grote rol spelen bij de overleving van bepaalde bacteriesoorten in extreme milieus. Het hoeft dan ook geen verwondering te wekken dat sporenvormende bacteriën overwegend gevonden worden in de grond en in wateren die hoge temperaturen bezitten (zoals geisers). In oppervlaktewateren bestaat de bacteriepopulatie voor meer dan 90% uit nietsporenvormers. Hoewel de precieze mechanismen die de sporenvorming op gang brengen nog niet bekend zijn, kan men in het algemeen wel zeggen dat cellen die zich in een milieu bevinden dat ongunstig is voor verdere groei, sporen beginnen te vormen. Als de milieuomstandigheden zodanig zijn dat groei weer mogelijk is, ontkiemen de sporen en vormen vegetatieve cellen (één vegetatieve cel per endospore). AB – Biotechnologie & Microbiologie 15 Figuur 6 Elektronenmicroscopische opname (x 33.540) van een sporenvormende bacterie: links de ovaalvormige spore, rechts gebieden met vetachtige stoffen 1.2.3 Naamgeving De microbiologen hebben uiteraard geprobeerd om de bacteriën zo goed mogelijk te karakteriseren en van een passende naam te voorzien. De dubbele naamgeving die door Linnaeus in de biologie werd geïntroduceerd, is door de microbiologen overgenomen. De eerste aanduiding in de naam is de geslachtsnaam. Die wordt gevolgd door de soortaanduiding. Bijvoorbeeld: Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Bacillus subtilis, … Binnen de soort wordt verder nog een onderverdeling gemaakt in stammen, bv. E.coli K12. Dit is noodzakelijk omdat binnen een soort nog een variatie in eigenschappen blijkt te bestaan. Deze variatie, die spontaan kan voorkomen, maar ook door de mens kan worden geïntroduceerd, heeft meestal betrekking op een gering aantal eigenschappen, zoals gevoeligheid voor antibiotica en specifieke groeibehoeften. Het is dus mogelijk dat er bacteriestammen zijn, die alle behoren tot de soort Pseudomonas aeruginosa, doch die onderling van elkaar verschillen in hun gevoeligheid voor antibiotica. 1.2.4 Voortplanting en groei 1.2.4.1 Voortplanting Bacteriën vermenigvuldigen zich over het algemeen door dwarsdeling (zie Figuur 7 en Figuur 8). Eerst wordt het DNA (genetisch materiaal) gerepliceerd, dit wil zegger er wordt nog eenzelfde DNA-molecule gemaakt. Gelijktijdig met de verdubbeling van het DNA verdubbelt ook het DNA van de plasmiden. Daarna vormt zich een dwarswand en ontstaan AB – Biotechnologie & Microbiologie 16 twee dochtercellen. Deze groeien uit tot volwassen cellen, waarna weer deling optreedt, enzovoort. In optimale omstandigheden kan de deling zich voltrekken in ca. 20 minuten. Figuur 7 Staphylococcus sp. (x 52 000). Centripetale vorming van de celwand Figuur 8 Celsplitsing van een prokaryotische cel (het nieuwe chromosoom is in kleur) Een klein aantal bacteriën vermenigvuldigt zich via een asymmetrische celdeling, knopvorming. De Actinomyceten die een mycelium vormen, kunnen (net als schimmels, die ook een mycelium vormen) een nieuw mycelium vormen door fragmentatie of uit (exo)sporen. AB – Biotechnologie & Microbiologie 17 Naast de hierboven vermelde ongeslachtelijke voortplanting kan er soms ook een vorm van geslachtelijke voortplanting optreden, hierbij is er sprake van één of andere vorm van uitwisseling van DNA tussen twee bacteriën. Er bestaan drie mechanismen: conjugatie, transformatie en transductie. In geval van conjugatie wordt genetisch materiaal tussen twee cellen overgedragen. Twee bacteriecellen gaan hiertoe vlak naast elkaar liggen en vormen een cytoplasmatische brug waarlangs DNA van de donor- naar de receptorcel wordt overgedragen (zie Figuur 9). Er vindt geen wederzijdse DNA-overdracht plaats. Figuur 9 Conjugatie tussen twee bacteriën (x 19.500) Tijdens transformatie neemt een bacterie DNAfragmenten op die uit dode cellen zijn vrijgekomen. In het geval van transductie brengen virussen (bacteriofagen) DNAfragmenten van de ene op de andere bacterie over. 1.2.4.2 Groeifasen Wanneer een klein aantal bacteriën van een bepaalde soort geënt wordt in een vloeibaar medium, kan men in een zogenaamde batch culture (dit wil zeggen een gesloten systeem waarin geen medium ververst wordt) een aantal fasen in het groeiproces onderscheiden (zie Figuur 10). AB – Biotechnologie & Microbiologie 18 Figuur 10 Groeifasen bij bacteriën De lag-fase ('to lag' = dralen) is de tijdspanne tussen het enten van de bacteriën en de start van de celdelingen, de aanpassingsperiode aan het aangeboden medium. De duur varieert van soort tot soort en is uiteraard ook afhankelijk van het milieu (oud of vers medium, temperatuur, pH, …). Tijdens deze fase synthetiseren de bacteriën enzymen voor de aanmaak van aminozuren en vitaminen. Daarna beginnen de cellen te delen. Wanneer de cellen zich met constante snelheid delen, zal het aantal cellen met de tijd exponentieel toenemen. Men spreekt dan van de exponentiële of logaritmische groeifase (logfase). De snelheid waarmee het aantal toeneemt hangt af van de generatietijd, dit is de tijd die verloopt tussen twee opeenvolgende delingen. De generatietijd hangt af van de bacteriesoort en van de condities in de cultuur. Onder optimale omstandigheden kan de generatietijd soms zeer kort zijn, bijvoorbeeld voor Beneckea natriegens minder dan 10' en voor Escherichia coli 15 - 20'. Als E. coli deze snelheid van deling gedurende 24 uur zou kunnen volhouden, zouden uit één cel ca. 1021 cellen gevormd zijn, een astronomisch aantal met een gezamenlijk gewicht van ongeveer vierduizend ton. Andere bacteriën hebben echter een veel langere generatietijd, een extreem voorbeeld is de tuberculosebacterie die in het laboratorium onder optimale omstandigheden een generatietijd heeft van 18 uur. Ook sommige methaanvormende bacteriën en de cyanobacteriën groeien erg langzaam. AB – Biotechnologie & Microbiologie 19 Vertrekkende van één bacteriecel tellen we na een bepaalde groeitijd 2n cellen, verstreken tijd waarbij n = aantal generaties = ------------------generatietijd In iedere cultuur komt het moment dat de groei tot stilstand komt, de stationaire fase. Het stoppen van de groei wordt meestal veroorzaakt door het opraken van een essentiële voedingsstof of door het ophopen van giftige stoffen. Ten slotte komt het moment dat er meer cellen afsterven dan er bij gevormd kunnen worden, het medium is dan bijna uitgeput, de afstervingsfase. 1.2.4.3 Milieu-eisen A Temperatuur Elk micro-organisme kent een bepaald temperatuurtraject waarbinnen het kan groeien. De optimumtemperatuur is die temperatuur waarbij het organisme het beste (in dit verband te verstaan als het snelste) groeit. • De psychrofiele organismen groeien tussen 0°C en 30°C. • De mesofiele organismen (de meerderheid van de bacteriën) groeien bij temperaturen van 20°C tot 45°C met een optimum tussen 30°C en 40°C. Parasieten van warmbloedigen hebben een optimum van ca. 37°C. • De thermofiele organismen kunnen groeien bij temperaturen tot 70°C en 80°C (de extreem thermofiele nog hoger), hun minimumtemperatuur ligt boven 40°C. Gematigd thermofiele bacteriën worden veelvuldig aangetroffen in grote hopen in afbraak verkerend organisch materiaal, zoals hooibergen, waarin de temperatuur sterk kan stijgen (hooibroei) en in warme bronnen. Extreem thermofiele bacteriën vindt men vooral in hete bronnen. Deze hebben optimum temperaturen tussen 65°C en 105°C. B Zuurstof Obligaat aerobe bacteriën groeien alleen in aanwezigheid van zuurstof. Facultatief anaerobe bacteriën groeien zowel met als zonder zuurstof. Obligaat anaerobe bacteriën AB – Biotechnologie & Microbiologie 20 groeien alleen in afwezigheid van zuurstof. Micro-aerofiele bacteriën hebben slechts een kleine hoeveelheid zuurstof nodig om te groeien. C pH Groei van de meeste micro-organismen (de neutrofiele) is mogelijk bij pH-waarden tussen 6 en 8. Buiten deze grenzen is groei ook mogelijk, maar dit is minder frequent. In anaerobe zure milieus is geen groei mogelijk. (Hierop berust de houdbaarheid van zuurkool, karnemelk en houten palen in veengrond.) Toch zijn er ook organismen die acidofielzijn en kunnen groeien bij een pH van 1 en er bestaan alkalifiele die optimaal groeien bij pHwaarden boven 9. D Osmotische druk en wateractiviteit De osmotische druk wordt veroorzaakt door in het water opgeloste verbindingen, zoals suikers en zouten (meer verbindingen = hogere osmotische druk). Niet te grote schommelingen in osmotische druk kunnen door micro-organismen weerstaan worden. Bacteriën reageren op dergelijke schommelingen door hun intracellulaire osmotische druk te reguleren. Men treft in de natuur obligaat halofiele bacteriën aan. Deze bevinden zich in zeewater en kunnen slechts groeien in aanwezigheid van een aanzienlijke zoutconcentratie (0,5 M NaCl). Voedingsmiddelen zijn houdbaar te maken door ze in een milieu met hoge osmotische waarde te bewaren, dit is inzouten. De wateractiviteit of aw is een maat voor de hoeveelheid ongebonden water in een substraat ten opzicht van al het aanwezig water. Een aw van 1 betekent dat al het water ongebonden is. Naarmate er meer waterbindende stoffen zoals suikers en zouten aanwezig zijn in het substraat, daalt de aw waarde. De meeste bacteriën kunnen groeien bij een aw boven 0,90. Schimmels verkiezen een aw tussen 0,65 en 0,80. Osmofiele gisten (gisten behoren ook tot het schimmelrijk) kunnen groeien in substraten met hoge osmotische waarde (aw = 0,60), bijvoorbeeld confituur (hoge suikerconcentratie). Ter situering van deze aw-waarden: de aw van gedroogde producten (o.a. hooi) bedraagt minder dan 0,70. Hierop is dus geen bacteriële activiteit mogelijk. AB – Biotechnologie & Microbiologie 21 1.2.4.4 Voedingsbehoeften Om in leven te blijven hebben organismen stoffen uit de omgeving nodig voor de energievoorziening en voor de opbouw van nieuw protoplasma. We noemen deze stoffen voedingsstoffen, of ze nu van organische of anorganische aard zijn. Op basis van hun voedingsbehoeften kunnen organismen onderverdeeld worden naar energiebron en koolstofbron (zie Tabel 1). Tabel 1 Energie- en koolstofbron van organismen Bron Groeitype Energiebron licht fototrofie redoxreactie: ✓ anorganische e-donor ✓ organische e-donor chemotrofie: ✓ lithotrofie ✓ organotrofie C-bron CO2 autotrofie organisch heterotrofie A Energiebron Organismen die licht als energiebron gebruiken vertonen fotosynthese en hebben dus chlorofyl nodig. Alle organismen die licht nodig hebben voor de groei, noemt men fototrofe organismen. Via redoxreacties kan energie beschikbaar gemaakt worden die gebruikt kan worden voor de groei (chemotrofie). Organismen die een anorganische elektronendonor (bijv. Fe2+, H2, NH3) gebruiken worden (chemo)lithotroof genoemd. Wordt een organische elektronendonor gebruikt (glucose, aminozuren) dan spreekt men van (chemo)organotroof. B Koolstofbron Veel bacteriesoorten kunnen, net als planten, de koolstofhoudende verbindingen waaruit zij bestaan synthetiseren vanuit CO2. Organismen die in staat zijn tot CO2-fixatie noemt men autotroof. Autotrofe organismen (planten, wieren, bepaalde bacteriën) kunnen zichzelf dus AB – Biotechnologie & Microbiologie 22 in een zuiver anorganisch milieu handhaven, doordat ze hun eigen organische stoffen kunnen opbouwen uit anorganische grondstoffen. Wanneer het organisme organische verbindingen (bv. suikers, aminozuren, eiwitten) nodig heeft voor de biosynthese van celmateriaal, zoals het geval is bij de meeste bacteriën (en dieren), dan noemt men het heterotroof. Heterotrofe organismen (dieren, schimmels en de meeste bacteriën) kunnen anorganische moleculen niet in organische ombouwen en moeten dus organische moleculen kant en klaar uit hun omgeving opnemen. De termen die hierboven zijn geïntroduceerd worden vaak gecombineerd. Een foto-autotroof organisme is dus in staat energie uit licht (fotosynthese) te benutten en CO2 te fixeren (bv. een plant) terwijl de mens een (chemo)organoheterotroof organisme is. Een organisme dat ammonium oxideert om energie te genereren (ammonium is dus elektronendonor) en CO2 fixeert is dus (chemo)lithoautotroof. 1.2.5 Taxonomie Hoewel de aanwezigheid van flagella en sporen en het uiterlijk van kleine en grote celaggregaten (koloniën) een identificatie zeker vergemakkelijkt, is een ondubbelzinnige identificatie op deze wijze niet mogelijk. Daarom worden in de klassieke taxonomie ter bepaling van geslacht (in taxonomische zin) en soort biochemische eigenschappen gebruikt. De volgende biochemische eigenschappen zijn van belang: • Celwandsamenstelling: als eerste indicatie geldt hiervoor het resultaat van de Gramkleuring. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen Grampositieve en Gramnegatieve bacteriën. • Koolstof- en energiebron: zie 1.2.4.4 • Gedrag t.o.v. zuurstof: zie 1.2.4.3B • Stofwisselingseigenschappen: met inachtneming van de koolstof- en energiebron, bepaalt men meer gedetailleerd tot welke metabolische omzettingen een bacteriesoort in staat is: ✓ Groeiomstandigheden: men bepaalt bijvoorbeeld welke soorten koolstofbron (suikers, aminozuren, CO2, CH4), stikstofbron (aminozuren, NH4 + , NO3 - , N2) of zwavelbron (aminozuren, S2- , SO4 2- ) door de bacterie gebruikt kunnen worden voor de synthese van nieuw celmateriaal. AB – Biotechnologie & Microbiologie 23 ✓ Productvorming: sommige bacteriën kunnen een koolstofbron, bijvoorbeeld glucose vergisten. Hierbij ontstaan bepaalde producten die vaak karakteristiek zijn voor een geslacht of soort. ✓ Enzymactiviteit: sommige bacteriesoorten of -groepen bezitten zeer kenmerkende enzymen, bv. katalase (een waterstofperoxide afbrekend enzym) en urease (afbraak van ureum). Onderstaand systematisch overzicht van de Prokaryota is gebaseerd op het referentiewerk bij uitstek voor bacteriële taxonomie, Bergey's 'Manual of Systematic Bacteriology'. Elektronenmicroscopisch onderzoek en biochemisch onderzoek naar de RNAsamenstelling van de ribosomen hebben duidelijk gemaakt dat er twee grote groepen bacteriën zijn, de Archaebacteriën en de Eubacteriën. De eerste groep komt voor in zeer extreme omstandigheden, vergelijkbaar met de milieuomstandigheden die heersten tijdens het ontstaan van de aarde. AB – Biotechnologie & Microbiologie 24 Domein of superrijk Archaea Rijk Crenarchaeota Bevat thermofiele en hyperthermofiele zwavelmetaboliserende organismen Rijk Euryarchaeota Bevat voornamelijk methanogene en halofiele bacteriën, maar ook thermofiele, zwavelreducerende bacteriën Domein of superrijk Eubacteria Rijk Aquificae Autotrofe bacteriën zoals Aquifex en Hydrogenobacter die waterstof gebruiken voor hun energieproductie. Aquifex, wat 'watermaker' betekent, produceert echt watermoleculen. Deze groep bevat sommige van de meest gekende thermofiele organismen Rijk Deinococci G+ en G- bacteriën die extreem resistent zijn tegen straling, mogelijk door de hoge concentraties aan carotenoïde pigmenten; unieke lipiden. Bv. Deinococcus, Deinobacter Rijk Chloroflexi G-. O.a. de groene niet-zwavelbacteriën, die geen lipopolysachariden in de buitenste membranen bezitten, maar wel ongewone peptidoglycanen; sommige doen aan anoxygene (geen zuurstofproducerende) fotosynthese. Bv. Chloroflexus Rijk Cyanobacteria Deze groep bevat Prochloron en de klassieke cyanobacteriën; ze doen aan oxygene fotosynthese via de Calvincyclus, zoals groene planten en sommige purperbacteriën. Bv. Nostoc, Anabaena. Oscillatoria Rijk Chlorobia De groene zwavelbacteriën die anoxygene fotosynthese uitvoeren; zij oxideren sulfide tot zwavel. Bv. Chlorobium Rijk Proteobacteria G-. De purperbacteriën, een zeer grote, complexe groep die onderverdeeld wordt in vijf subgroepen, aangeduid met de Griekse letters (In drie van de vijf subgroepen worden fotosynthetiserende bacteriën gevonden zodat men aanneemt dat de volledige groep een gemeenschappelijke fotosynthetiserende voorouder had. Vermoedelijk verloren vele vormen dat vermogen door adaptatie aan nieuwe ecologische milieus). Veel soorten zijn belangrijk in de geneeskunde, industrie of voor onderzoek. Bv. Campylobacter, Rickettsia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas, Salmonella AB – Biotechnologie & Microbiologie 25 Een groep G+ bacteriën met laag G-Cgehalte (de organische basen guanine en cytosine) omvatten enkele belangrijke klassen, o.a. klasse Clostridia en verwanten anaëroob; vormen endosporen, bv. Clostridium klasse Mollicutes of mycoplasmabacteria hebben geen celwand (dus zeker G-), niet beweeglijk, hebben in tegenstelling met bijna alle andere bacteriën sterolen nodig voor groei, bv. Mvcoplasma klasse Bacilli, met de ordes Bacillales, Lactobacillales G+ staafjes en kokken. aëroob of facultatief anaëroob, sommige vormen sporen, veel medisch en industrieel belangrijke soorten, bv. Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Listeria, Staphylococcus Een groep G+ bacteriën met hoog G+C-gehalte: klasse Actinobacteria zeer heterogene groep met kokken, regelmatige en onregelmatige staafjes, vertakkende hyfen, bv. Actinomyces, Corynebacterium, Mycobacterium, Micrococcus Rijk Planctomycetes Orde Planctomycetales G-, ronde ovale of peervormige cellen, geen peptidoglycaan; normaal, zoals Planctomycetes, eencellig, maar Isosphaera kan ketens vormen; delen door knopvorming Orde Chlamydiales obligate intracellulaire parasiet, kokken, geen peptidoglycaan, pathogeen voor de mens. Chlamydia Rijk Spirochaetes Spiralige bouw, beweeglijk, axiale filamenten of axiale fibrillen aanwezig tussen het buitenste en het binnenste (plasma) lipoproteïne membraan van de Gcelwand. Vrijlevend, symbiotisch of parasitair. Borellia en Treponema zijn menselijke pathogenen Rijk Fibrobacteres G- bacteriën. Bv. Fibrobacter Rijk Bacteroides Alle Gdivisio Bacteroides AB – Biotechnologie & Microbiologie 26 beweeglijke en onbeweeglijke staafjes, obligaat anaëroob, vormt geen sporen, in mondholte en darmkanaal van de mens en andere dieren, en in de pens van herkauwers (Bacteroides ruminicola) divisio Sphingobacteria sphingolipiden in de celwand. Bv. Sphingobacterium Rijk Fusobacteria G-, anaëroob. Fusobacterium leeft in de keelholte van de mens Naast de wetenschappelijke naamgeving en indeling hanteert men ook heel vaak een op de praktijk gerichte indeling en naamgeving. Het is niet ongebruikelijk dat microbiologen bacteriën indelen en aanduiden naar de plek waar ze zich meestal ophouden, ze spreken bijvoorbeeld over darmbacteriën of over bodembacteriën. Daarnaast wordt heel vaak ingedeeld naar bijzondere fysiologische eigenschappen, men spreekt bijvoorbeeld over thermofiele bacteriën, over stikstofbinders of over melkzuurbacteriën. Het zal duidelijk zijn dat in die laatste gevallen sprake is van een verzameling van soorten met één opvallende gemeenschappelijke eigenschap, zoals het van nature voorkomen in de darm of in de bodem, het kunnen groeien bij hoge temperaturen, het vermogen om stikstof te binden of melkzuur te vormen. 1.2.6 Doden van microorganismen 1.2.6.1 Pasteurisatie en sterilisatie Vanuit de medische biologie en de voedingsmiddelentechnologie heeft er altijd grote interesse bestaan in het actief doden van micro-organismen. Omdat alle levende wezens eiwitten en nucleïnezuren (DNA, RNA) bevatten, heeft men gezocht naar methoden om deze polymeren te beschadigen, waardoor levensvatbaarheid vernietigd wordt. De meest eenvoudige methode is verhitting. Als men cellen gedurende 5 minuten op 80°C verwarmt, dan zijn deze cellen dood. Dit wordt voornamelijk veroorzaakt door het denatureren van eiwit. Deze techniek noemt men het pasteuriseren. Een nadeel is echter dat endosporen op deze wijze niet gedood worden. Steriliteit wordt dus niet verkregen. Voor sterilisatie is een hogere temperatuur nodig. Omdat eiwitten in een waterig milieu sneller denatureren dan in een droge omgeving, is het zeer belangrijk hoe men steriliseert. Voor vloeistoffen is het voldoende om deze 20 minuten op 120°C te verhitten. Dit bereikt men door deze AB – Biotechnologie & Microbiologie 27 vloeistoffen onder 1 atmosfeer overdruk in een zogenaamde autoclaaf te verhitten. Droge materialen kunnen, mits ze vochtig mogen worden, op dezelfde wijze in stoom worden gesteriliseerd. Moet het materiaal droog blijven dan moet men in droge lucht steriliseren. Dit moet dan wel gebeuren bij hogere temperaturen en gedurende langere tijd: 2 tot 3 uur bij 240°C. Entnaalden steriliseert men door ze in een vlam te gloeien. Vele materialen mogen niet verhit worden. Hierbij worden andere technieken toegepast. Men kan deze materialen chemisch steriliseren door ze te behandelen met stoffen die steriliserend werken (formaline of methanol, ethyleenoxide, jodium, ethanol). Oplossingen van stoffen die niet tegen verhitting kunnen, kunnen worden gefiltreerd door een bacteriefilter. Dit filter heeft zeer kleine poriën waar bacteriën en sporen niet doorheen kunnen. Virussen kunnen op een dergelijke wijze moeilijker worden verwijderd. Een alternatief is het bestralen met gamma- of ultraviolette straling. Dergelijke straling beschadigt het DNA en RNA en verhindert, mits toegepast in voldoende dosis, verdere groei van cellen, sporen en virussen. 1.2.6.2 Antibiotica De bovenvermelde sterilisatietechnieken hebben alle als nadeel dat zij elk leven vernietigen. Dit betekent dat zij niet toegepast kunnen worden bij de bestrijding van infectieziekten. Daarom zijn geneesmiddelen ontwikkeld die in het ideale geval wel het infecterend organisme doden, maar onschadelijk zijn voor de mens. Een aparte plaats wordt bij deze geneesmiddelen ingenomen door de antibiotica, omdat deze stoffen door microorganismen zelf worden geproduceerd. Het eerste antibioticum dat ontdekt werd, is penicilline. Fleming nam in 1929 waar dat een cultuur van Staphylococcus aureus op agar, die bij toeval was besmet met een schimmel, ten gevolge van deze besmetting stopte met groeien. De schimmel bleek Penicilium notatum te zijn. Fleming concludeerde dat deze schimmel een stof uitscheidde die bacteriedodend was. Deze stof werd later geïsoleerd en penicilline genoemd. Het is een zeer goed antibioticum, omdat het zeer specifiek tegen bacteriën werkt, het verhindert de opbouw van het peptidoglycaan. Aangezien dit celwandpolymeer niet bij eukaryote cellen voorkomt, heeft penicilline tegen deze cellen geen dodende werking. Er zijn sinds 1929 vele antibiotica gevonden. Streptomycine (geproduceerd door de bacterie Streptomyces griseus) en chloramphenicol (geproduceerd door Streptomyces venezuelae) werken beide door binding aan prokaryote ribosomen, AB – Biotechnologie & Microbiologie 28 waardoor de eiwitsynthese wordt geremd. Tegenwoordig wordt de effectiviteit van antibiotica verhoogd door kleine veranderingen in bestaande antibiotica aan te brengen. Vaak zijn organismen die resistent zijn (geworden) tegen het oorspronkelijke antibioticum dat (nog) niet tegen de gewijzigde vorm. De antibioticatherapie is echter niet zaligmakend, er komen steeds meer antibioticaresistente bacteriën voor. Overal in de wereld duikt een resistente Staphylococcus aureus stam, die met de afkorting MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus) aangeduid wordt, als ziekenhuisbacterie op. Deze bacterie is resistent tegen vrijwel alle antibiotica. 1.2.7 Het aantonen van bacteriën Men kan - jammer genoeg - niet met het blote oog zien of er in de organen van een mens of dier bacteriën voorkomen en of voer, drinkwater of strooisel levende bacteriën bevat. Evenmin kan men met het blote oog zien of materialen die in een autoclaaf of droogsterilisator behandeld zijn of op gedesinfecteerde voorwerpen en vloeren, overeenkomstig de verwachting (voor het grootste deel) gedood zijn. Het gemakkelijkste is dat vast te stellen met behulp van voedingsbodems waarop bacteriën zich kunnen vermenigvuldigen. Vloeibare voedingsbodems worden gebruikt in buizen die met een wattenprop of een metalen deksel zo worden afgesloten, dat er geen bacteriën in kunnen komen, maar wel voldoende zuurstof. Als voedingsbodem voor de bacteriën wordt vaak een vleesextract gebruikt waaraan zouten, suikers en ook wel bloed zijn toegevoegd. Aan de vloeibare voedingsmediums wordt vaak wat agar toegevoegd, waardoor een stijve, zogenaamde vaste voedingsbodem ontstaat. Het vaste medium wordt in een dunne laag in een petrischaal (petriplaat) gebruikt. Om aan te tonen of er in materiaal (bijvoorbeeld voeder of weefsel) bacteriën aanwezig zijn, wordt van dat materiaal met een uitgegloeide metaaldraad (öse) of een steriele wattenprop over het oppervlak van een plaat gestreken of in een buis gebracht. Of in het materiaal levende bacteriën aanwezig waren, kan na een dag worden afgelezen aan het feit of er wel of geen groei van bacteriën wordt gezien. Als in een vloeibare voedingsbodem bacteriën groeien, wordt de vloeistof troebel. Als op een plaat bacteriën groeien, ziet men aan de oppervlakte kolonies ontstaan, witte of kleurloze en soms gele plekjes met een grootte van 0,5 tot 2 mm. Door speciaal onderzoek kan worden vastgesteld, met welk soort bacterie men te maken heeft. AB – Biotechnologie & Microbiologie 29 1.3 Betekenis van bacteriën en schimmels Bij mensen die niet geschoold zijn in de microbiologie overheerst vaak een negatief gevoel als het om bacteriën gaat. ‘Bacteriën zijn kleine beestjes die je ziek maken’, is vaak het antwoord op de vraag om een omschrijving te geven van bacteriën. Deze uitspraak over bacteriën is in feite totaal misplaatst, omdat uitsluitend wordt verwezen naar een minderheid in de bacteriewereld. Immers, de meerderheid van de gekende bacteriën is onschadelijk. Sommige zijn zelfs nuttig voor de mens of onmisbaar voor het leven op aarde. In dit onderdeel zullen voorbeelden gegeven worden van schadelijke en nuttige bacteriesoorten. De keuze is betrekkelijk willekeurig en in elk geval zeer beperkt. 1.3.1 Ecologie (kringlopen) Bacteriën komen vrijwel overal voor: in de lucht, in het water, op het land, op de huid en in ingewanden van mens en dier, op planten, enzovoort. Men treft ze aan in gematigde milieus, maar ook onder extreme omstandigheden, zoals die heersen in hete bronnen, op Antarctica en in zoutmeren (bv. de Dode Zee). Dergelijke bacteriën zijn vaak zelfs aan die milieus gebonden (thermofiele, psychrofiele, halofiele bacteriën). Terwijl men zich meestal vooral bewust is van de mogelijke gevaren van een betrekkelijk gering aantal ziekteverwekkende bacteriesoorten, staat men in de regel onvoldoende stil bij het nut van bacteriële activiteiten in de natuur. De totale hoeveelheid biomassa die ooit gevormd is geweest sinds het ontstaan van leven op aarde, is veel groter dan de totale massa van de aarde, daarom kunnen we concluderen dat binnen het gesloten systeem ‘aarde’ cycli voor de diverse elementen moeten bestaan. 1.3.1.1 Koolstof Koolstof komt in de natuur voor als CO2, bicarbonaat (HCO3 - ), carbonaat (CO3 2- ), vrije koolstof en organische koolstof (C in organische verbindingen). Planten (en bepaalde micro-organismen) kunnen CO2 gebruiken voor de opbouw van organische verbindingen (o.a. via de fotosynthese). Deze opgebouwde organische verbindingen kunnen weer als voeding dienen voor andere levende wezens. Bij de afbraak van organische koolstofbronnen komt weer CO2 vrij en de cyclus is weer gesloten. Bacteriën spelen een belangrijke rol bij de afbraak van organisch materiaal. Terwijl schimmels in dit opzicht AB – Biotechnologie & Microbiologie 30 vooral in de bodem ook belangrijk kunnen zijn zolang voldoende zuurstof aanwezig is (en bij lagere pH), spelen onder anaerobe omstandigheden bacteriën de hoofdrol. De afbraak van organisch materiaal tot CO2 is een essentiële stap uit de koolstofkringloop, die ervoor zorgt dat CO2, dat in betrekkelijk lage concentratie in de atmosfeer aanwezig is en dus al spoedig op zou raken, weer beschikbaar komt voor de plantengroei. De omzetting van organisch materiaal in anorganische verbindingen (CO2, NH4 +, NO3 - , PO4 3- , H2S, SO4 2- ) noemt men mineralisatie. 1.3.1.2 Stikstof In de stikstofkringloop nemen bacteriegroepen een centrale plaats in: de nitrificerende, denitrificerende en stikstoffixerende bacteriën. Stikstof komt als N2 (gas) voor in de atmosfeer. Daarnaast komt stikstof ook voor in plantaardig en dierlijk materiaal (o.a. in eiwitten en nucleïnezuren). Door afbraak van dergelijk materiaal in de bodem komt stikstof in het milieu terecht in de vorm van ammonium. Verder zit stikstof in de vorm van nitraat in de bodem en als gasvormige N-oxiden in de lucht. Veel van de genoemde N-verbindingen kunnen in het milieu in elkaar overgaan, waardoor een kringloop ontstaat en voorkomen wordt dat stikstof slechts in één bepaalde chemische vorm wordt opgeslagen. A N-fixatie Uit de scheikunde weten we dat N2 en H2 slechts onder zeer hoge druk en bij extreem hoge temperatuur reageren tot ammoniak (het bekende Haber-Bosch-procédé, toegepast in de kunstmestindustrie). In dat licht bezien is het zeer opmerkelijk dat sommige bacteriën diezelfde chemische reactie met behulp van specifieke enzymen bij normale temperatuur en onder atmosferische druk kunnen uitvoeren. We doelen hier met name op de groep Nbinders waartoe het plantsymbiotische geslacht Rhizobium behoort, maar ook vrijlevende soorten, bijvoorbeeld het geslacht Azotobacter. Ze zijn in staat tot N-fixatie. Al heel lang hebben mensen in de landbouw bewust gebruik gemaakt van deze bacteriën, door N-arme gronden op een natuurlijke manier met N-bindende bacteriën te bemesten. Veelal gebeurde dat door het onvruchtbare land te bebouwen met vlinderbloemige gewassen zoals lupinen, erwten, die in symbiose leven met de (N-bindende) Rhizobium-bacteriën. Door de planten aan het einde van het seizoen onder te ploegen, komt via de afbraak van AB – Biotechnologie & Microbiologie 31 de planten minerale N in de bodem terecht, waarna de bodem bebouwd kan worden met cultuurgewassen en een natuurlijke N-kringloop ontstaat. B Ammonificatie Ammonificatie is de mineralisatie van organische N-verbindingen tot ammonium of ammoniak. Plantaardig en dierlijk organisch materiaal (bv. afgevallen bladeren, stalmest) wordt door micro-organismen afgebroken tot ammoniak of ammonium. C Nitrificatie Het gevormde ammoniak of ammonium kan in de bodem door bacteriën van het geslacht Nitrosomonas worden omgezet in nitriet (= nitritatie). Een andere groep bacteriën, van het geslacht Nitrobacter, weet nitriet om te zetten tot nitraat (= nitratatie). Nitritatie en nitratatie samen worden als nitrificatie bestempeld, de omzetting van ammoniak of ammonium naar nitraat. D N-opname door planten en andere organismen Nitraat is een geschikte N-bron voor de planten die dit, evenals ammoniak (ammonium), uit de bodem opnemen. E Denitrificatie Nitraat kan in anaerobe omstandigheden (doornatte bodem) ook door zogeheten denitrificerende bacteriën worden omgezet tot N2 en in die vorm weer worden teruggevoerd naar de atmosfeer, waarmee de kringloop weer gesloten is. In Figuur 11 is te zien welke rol bacteriën spelen in de kringloop van het element N. AB – Biotechnologie & Microbiologie 32 Figuur 11 Schema van de natuurlijke stikstofkringloop 1.3.2 Afvalwaterzuivering Veel van wat als afval in ons milieu terechtkomt, wordt microbieel afgebroken. Dat we desondanks afvalproblemen hebben, komt doordat we, als gevolg van het gebruik van grote hoeveelheden uiteenlopende onnatuurlijke chemische producten, het milieu zodanig belasten dat de micro-organismen het niet meer goed aankunnen. We produceren in dichtbevolkte gebieden zoveel afvalwater, dat directe lozing van al dat afvalwater op het oppervlaktewater, zoals vroeger gebruikelijk, rampzalig zou zijn. Er zou dan zoveel organisch materiaal in het water terechtkomen dat bij de afbraak daarvan, door aerobe micro-organismen, alle zuurstof uit het water zou verdwijnen, met als gevolg 'dood' water waarin uitsluitend door anaerobe vergisting nog enige biologische afbraak plaats zou kunnen vinden. De aanleg van een rioleringssysteem en een daaraan gekoppelde rioolwaterzuivering is van onschatbare waarde voor ons milieu. Het afval dat bij de AB – Biotechnologie & Microbiologie 33 waterzuiveringsstations binnenstroomt wordt in de meeste gevallen eerst ontdaan van grof materiaal. Vervolgens gaat het afvalwater naar een eerste bezinktank. Deze twee stappen horen bij de primaire zuivering. De onopgeloste stoffen worden afzonderlijk (anaeroob) vergist. Het water dat overblijft, rijk aan opgeloste organische verbindingen en allerlei micro-organismen bevattend, wordt overgebracht naar een beluchtingstank. Daarin vindt de secundaire zuivering plaats, een aerobe biologische zuivering. Het organisch materiaal wordt door micro-organismen gemineraliseerd, dit wil zeggen afgebroken tot CO2, mineralen en water. De organische N-verbindingen worden gemineraliseerd tot ammonium (N-cyclus). De micro-organismen in dit bassin (bacteriën, fungi, protozoa) vormen met elkaar samenhangende 'vlokken' en zijn als dusdanig verantwoordelijk voor de microbiële omzetting van het opgeloste organisch materiaal. De suggestieve naam voor deze micro-organismen luidt actief slib. Voor de efficiënte afbraak is een goede beluchting van de tank noodzakelijk. Om dat te bereiken zijn allerlei technische systemen ontwikkeld, zoals roterende schoepen of borstels. Bij de afbraak van het organisch materiaal neemt de hoeveelheid micro-organismen (de biomassa) in de tank snel toe. Op gezette tijden wordt de inhoud van de tank daarom overgebracht naar een tweede bezinktank. Het slib zakt uit en dit bezinksel wordt daarna voor een deel teruggebracht naar de beluchtingstank (aanvoer van micro-organismen). Het grootste deel van het bezinksel wordt echter afgevoerd. De tertiaire zuivering is een uitbreiding van de secundaire. Hierbij worden voornamelijk de minerale N- en P-verbindingen uit het afvalwater gehaald. Dit kan in dezelfde tanks als de secundaire zuivering plaatsvinden. Het ammonium dat gevormd werd tijdens de mineralisatie (secundaire zuivering) wordt in aerobe omstandigheden door nitrificerende bacteriën omgezet naar nitraat. Andere bacteriën denitrificeren het nitraat in anaerobe omstandigheden (die gecreëerd worden in de tank) tot N-gas dat ontsnapt naar de lucht. Door het afvalwater dus afwisselend wel en niet te beluchten, zet men eerst het ammonium om naar nitraat en vervolgens het nitraat tot N-gas. Bemerk de sterke parallel tussen de biologische afvalwaterzuivering en de N-cyclus! Ook de fosfaten kunnen in afwisselend aerobe en anaerobe omstandigheden via biologische weg (bacteriën) uit het water gehaald worden (‘biologische fosfaatverwijdering’), maar daar wordt hier niet op ingegaan. AB – Biotechnologie & Microbiologie 34 1.3.3 Bacteriën en hygiëne Schone keuken: meer dan wenselijk (artikel uit Eos) Door voedsel veroorzaakte kwalen, zoals voedselvergiftiging en voedselinfectie, worden - zeker in deze tijden van voedselschandalen in veel gevallen ten onrechte toegeschreven aan de commerciële voedselproductie en bereiding. Ten onrechte, omdat de meeste voedselproblemen hun oorsprong vinden in onze eigen keuken. Ze ontstaan door voedingswaren op een verkeerde manier of te lang te bewaren, of door bij het bereiden van maaltijden onvoldoende hygiënisch te werk te gaan. Ofschoon het praktisch onmogelijk is onze keuken volkomen kiemvrij te houden, kunnen we met een paar eenvoudige voorzorgsmaatregelen toch het ergste voorkomen. Begin dit jaar nog eiste listeriose, een ziekte veroorzaakt door de bacterie Listeria monocytogenes, in Frankrijk zeven doden, waaronder twee pasgeborenen. Nadat eerst een aantal Franse kazen uit de schappen was gehaald, bleek de boosdoener varkenstong in gelei te zijn. Wereldwijd doodt besmet voedsel meer dan een miljoen mensen per jaar. Een klein deel van de voedselgebonden ziektes vindt zijn oorsprong in de voedselverwerkende industrie. In het overgrote deel van de gevallen ontstaat de besmetting bij de bereiding in de horeca, catering of in onze eigen keuken. We kunnen twee soorten van voedselgebonden ziekten onderscheiden: enerzijds de voedselintoxicaties of -vergiftigingen en anderzijds de voedselinfecties of -besmettingen. Bij voedselintoxicaties heeft een groei van microorganismen (bacteriën, gisten en schimmels) in het voedsel plaatsgevonden. Deze microorganismen hebben in het voedsel toxines - giftige stoffen die ziektes veroorzaken - gevormd. Bij het eten van met toxines besmet voedsel treden op zeer korte termijn - tot uiterlijk enkele uren na consumptie — ziekteverschijnselen op. Voorbeelden van micro-organismen die voedselvergiftiging kunnen veroorzaken zijn Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus en Clostridium botulinum. Anderzijds zijn er de voedselinfecties, waarbij het voedsel met een aantal ziekteverwekkende bacteriën werd geïnfecteerd. Deze bacteriën kunnen zich in het maagof darmkanaal verder ontwikkelen en ziektes veroorzaken. Ofschoon de ziekteverschijnselen veel weg hebben van die van intoxicaties, treden ze meestal later op, zo’n twaalf uur tot AB – Biotechnologie & Microbiologie 35 enkele dagen na het eten van het voedsel. Voorbeelden zijn besmettingen met Salmonella, Yersinia, Escherichia coli, Listeria monocytogenes en Campylobacter jejuni. In het kaderstukje ‘Onzichtbare vijanden’ krijgt u een overzicht van de bekendste microorganismen, de voedingswaren waarin ze meestal voorkomen, de symptomen waaraan u een vergiftiging of besmetting kunt herkennen en hun incubatieperiode. WE WORDEN OUDER, DUS DREIGT ER MEER GEVAAR Zowel voedselintoxicaties als -infecties komen relatief veel voor. Bij zware besmettingen wordt een relatief groot deel van de bevolking ziek, bij geringe besmettingen worden vooral personen met een verminderde immuniteit als baby’s, bejaarden, zieken en zwangere vrouwen getroffen, soms met ernstige gevolgen. Een besmetting met Listeria monocytogenes bijvoorbeeld kan een miskraam veroorzaken. Bovendien staat vast dat van een leeftijd van vijftig jaar af het natuurlijke verdedigingsmechanisme tegen voedselinfecties verzwakt. En aangezien de gemiddelde leeftijd van de bevolking de laatste jaren enorm is toegenomen, loopt de bevolking in haar geheel steeds meer gevaar. De oorzaak van door voedsel veroorzaakte ziektes is dikwijls moeilijk te achterhalen. Meestal wordt de voeding verwerkende industrie onmiddellijk met de vinger gewezen. Zeker in deze tijden van breed in de media uitgesmeerde voedselschandalen, is dat niet eens zo verwonderlijk. In het productieproces kan inderdaad van alles mislopen. Bij vlees bijvoorbeeld hangt de microbiologische kwaliteit van het uiteindelijke product af van een aantal stappen in het productieproces. Eerst en vooral is de algemene conditie van het dier van belang. Het vlees van een ongezond dier is uiteraard niet geschikt voor consumptie. Bij gezonde dieren zijn de hygiënische omstandigheden tijdens het fokken en mesten belangrijk, om er voor te zorgen dat micro-organismen ook bij hen geen kans krijgen. De meeste besmettingen worden bij dieren door ongedierte als muizen en insecten overgedragen. Helaas is het tot nu toe nog niet mogelijk de afwezigheid van micro-organismen volledig te garanderen. Bij de aankomst op de slachtlocatie zijn de dieren dan ook zelden volkomen bacterievrij. AB – Biotechnologie & Microbiologie 36 De meeste bacteriën bevinden zich in de darminhoud, de vacht en op de huid. Ofschoon de bacteriën in de meeste gevallen niet schadelijk zijn voor het dier, zijn ze dat wel voor de mens. Wanneer slachthandelingen onzorgvuldig of onhygiënisch worden uitgevoerd - bijvoorbeeld wanneer het vlees in contact kan komen met ingewanden of uitwerpselen - dan kan het vlees besmet raken. Bijkomend probleem voor voedselproducenten is dat de drukke westerling meer en meer voor voorgesneden producten en kant-en-klare maaltijden kiest. Dat betekent concreet dat de bereiding van de maaltijd en de consumptie ervan zowel qua plaats als tijd helemaal niet meer samenvallen, wat het gevaar voor de volksgezondheid aanzienlijk doet toenemen. Bovendien bevatten voorgesneden of geraspte groenten doorgaans meer bacteriën dan onbewerkte, aangezien er ook bij het versnijden een besmetting kan plaatsvinden. AB – Biotechnologie & Microbiologie 37 Ook bij de distributie kan iets fout lopen, meestal ten gevolge van onvoldoende koeling. Ofschoon het aantal kiemen in besmet voedsel doorgaans te laag is om ons ziek te maken, kan hun aantal bij onvoldoende koeling of te weinig hygiëne razendsnel toenemen. In het kaderstukje ‘Onzichtbare vijanden’ vindt u de temperaturen waarbij de vermelde microorganismen zich het snelst vermenigvuldigen. DE KIEMVRIJE KEUKEN BESTAAT NIET Toch ontstaat de besmetting in het overgrote deel van de gevallen niet bij het productieproces, maar bij de bewaring van de producten en bij de bereiding van de maaltijden in de horeca, catering of in onze eigen keuken. De meeste voedsel gebonden ziekten zijn immers een gevolg van een kruiscontaminatie bij de verwerking van producten. Wanneer besmet voedsel met andere levensmiddelen in contact komt of wanneer etenswaren op een besmet oppervlak worden gelegd, kan een besmetting zich snel uitbreiden. Zo bevinden zich in een ei zelden of nooit salmonellabacteriën, maar op de schaal vaak wel. Die kans is groter bij scharrelkippen, omdat hun eieren in contact kunnen komen met uitwerpselen en de Salmonella bacterie vaak in die uitwerpselen voorkomt. Wanneer we de eierschalen niet eerst schoonmaken, kunnen de bacteriën bij het breken van de schaal makkelijk in het eiwit of eigeel terechtkomen. Ook vliegende insecten als de huisvlieg en de aasvlieg kunnen allerlei ziekteverwekkende micro-organismen verspreiden. Helaas komen ook deze insecten veel vaker in onze eigen keuken voor dan in voedingsbedrijven. AB – Biotechnologie & Microbiologie 38 Ofschoon het onmogelijk is de keuken volledig kiemvrij te houden, kunnen we met enkele eenvoudige maatregelen het ergste voorkomen. Zo is het een absolute vereiste, vóór we met het bereiden van een maaltijd beginnen, grondig onze handen te wassen en ze met een schone handdoek af te drogen. Het is ook aan te bevelen na het werken met rauwe voedingswaren, waarop meer besmettingen kunnen voorkomen, de handen opnieuw te wassen. Ook handdoeken, sponsjes en vaatdoeken moeten geregeld worden gewassen, anders worden ze snel echte infectiehaarden. Ook het oppervlak waarop we werken, zoals het aanrecht en de gootsteen en alle gebruikte apparaten en keukengerei moeten smetteloos schoon zijn. Vaak wordt daarbij ook de afzuigkap vergeten, terwijl die zich net boven onze kookpotten bevindt. Ideaal is het aparte snijplanken te gebruiken voor rauw vlees, rauwe vis, vers fruit en verse groenten of ze geregeld te spoelen. Na gebruik worden de planken het best gereinigd met heet water en detergent. Bleekwater bijvoorbeeld is een uitstekend reinigend en ontsmettend middel dat zeer doeltreffend ziekteverwekkende microben uitschakelt. De planken gedurende vijf minuutjes in een verdunde bleekwateroplossing - 300 milliliter bleekwater per liter water - laten weken rekent met de meeste microben af. Uiteraard moeten we ze nadien grondig met zuiver water spoelen en ze voldoende laten drogen, zodat kiemen er geen voedingsbodem meer op vinden. AB – Biotechnologie & Microbiologie 39 Ofschoon het vaak voorkomt, hoort de kattenbak absoluut niet in de keuken thuis. Uitwerpselen zijn immers een grote bron van besmetting. Vuilemmers moeten goed worden afgesloten. Ook de koelkast en de diepvriezer moeten geregeld worden schoongemaakt en gedesinfecteerd. Ontsmetten kan pas nadat alle restjes voedsel werden verwijderd. Anders kunnen ze het te reinigen oppervlak afdekken en kan het ontsmettingsmiddel niet tot alle plaatsen doordringen. Ten slotte mogen we ook de kasten en opbergrekken niet uit het oog verliezen. AFKOELEN EN OPWARMEN Ook de manier waarop we voedingswaren in de koelkast bewaren speelt een belangrijke rol. Voedingswaren worden het best onmiddellijk na de aankoop in de koelkast opgeborgen. Zeker bij hoge buitentemperaturen moeten we ervoor zorgen dat etenswaren niet te lang in de auto blijven liggen. We laten de producten het best in hun originele, gesloten verpakking. Ideaal zijn vacuümverpakte producten, aangezien de meeste bacteriën, om zich te vermenigvuldigen, zuurstof nodig hebben. Na het openen van de verpakking moeten de voedingswaren worden afgedekt met een plastic- of aluminiumfolie, zodat sappen van rauw vlees of vis niet met andere etenswaren in contact kunnen komen. Doordat besmettingen vaker voorkomen op rauwe producten en makkelijk van het ene op het andere product kunnen overgaan, moet elk contact tussen rauwe en bereide gerechten worden vermeden. In de koelkast bewaren we rauwe producten dus het best niet boven bereide gerechten. Ideaal is de tijd tussen bereiding en consumptie zo kort mogelijk te houden, zeker bij zeer bederfelijke producten als gehakt. Producten waarvan de verbruiksdatum is overschreden komen uiteraard niet meer voor consumptie in aanmerking en kunnen bovendien andere etenswaren besmetten. Ze moeten dan ook onmiddellijk uit de koelkast worden verwijderd. De ideale temperatuur in de koelkast ligt net onder vier graden Celsius aangezien de vermenigvuldiging van de meeste kiemen bij deze temperatuur sterk vertraagt. Onderzoek heeft echter uitgewezen dat in meer dan de helft van de huishoudelijke koelkasten de temperatuur boven de tien graden Celsius uitstijgt. Het is dus beter de temperatuur in de koelkast geregeld te controleren, zeker in de zomer. Diepvriezers mogen maximaal op min achttien worden ingesteld. Een tweede manier om de kans op een besmetting te verlagen, is de maaltijden voldoende verhitten. Vooral niet of nauwelijks bewerkte etenswaren van dierlijke oorsprong zijn echte risicoproducten. De micro-organismen die zich eventueel in het voedsel bevinden, kunnen AB – Biotechnologie & Microbiologie 40 makkelijk worden gedood door de etenswaren op te warmen, op voorwaarde dat de temperatuur hoog genoeg is en lang genoeg aanhoudt. Zo moeten we er bijvoorbeeld voor zorgen dat het hart van het vlees gedurende minstens twee minuten zeventig graden Celsius warm is. Een steak is bijgevolg veiliger à point dan saignant of bleu. Door nooit rauw vlees te eten, zouden al veel gevallen van voedselvergiftiging kunnen worden voorkomen. Een hardgekookt ei is om dezelfde reden veiliger dan een zachtgekookt. Bij het opwarmen van gekoelde voedingswaren en het bereiden van bevroren voedsel geldt dezelfde regel. Voedsel dat in de magnetron wordt opgewarmd moet geregeld worden omgeroerd of omgekeerd, om ook daar een homogene opwarming mogelijk te maken. Doen we dat niet, dan kunnen bepaalde delen van de maaltijd nog koud zijn terwijl andere delen al gloeiend heet zijn, wat niet alleen weinig smakelijk is, maar ook gevaarlijk voor besmettingen. Helaas is het vaak onmogelijk aan het gerecht te zien of het al dan niet besmet is. Aangetaste producten kunnen er vaak nog heel appetijtelijk uitzien en zelfs nog uitstekend smaken. Rest ons dus alleen het kwaad zoveel mogelijk te vermijden. Hygiëne in de keuken is daarbij meer dan essentieel. AB – Biotechnologie & Microbiologie 41 AB – Biotechnologie & Microbiologie 42 OPDRACHTEN Lees het bovenstaande artikel uit Eos en denk na in welke mate jij in het dagelijkse leven hygiënisch te werk gaat. 1.3.4 Plantenziekten De plant wordt in de bodem geconfronteerd met allerlei micro-organismen. Het merendeel daarvan is nuttig voor de bodem en de voeding van planten, maar er zijn ook soorten die de plant parasiteren (voor het merendeel schimmels). Voorbeelden van plantpathogene bacteriën zijn: Erwinia, Agrobacterium, Corynebacterium, Pseudomonas. Als men planten in monocultuur langdurig teelt op één bepaald perceel, dan kan men heel goed zien dat gaandeweg plantschadelijke micro-organismen gaan floreren. De land- en tuinbouwers spelen op dat probleem in door regelmatig van gewas te verwisselen op een bepaald perceel. Daarnaast is het in de tuinbouwsector gebruikelijk om, waar vruchtafwisseling niet voor de hand ligt, met chemische middelen (grond-ontsmettingsmiddelen) de grond te ontdoen van allerlei schadelijke parasieten. Met het groeiende inzicht in de microbiologie dienen zich echter ook andere, milieuvriendelijke oplossingen aan om cultuurgronden te vitaliseren. Er zijn bacteriën in de bodem aanwezig, veelal vertegenwoordigers van het bacteriegeslacht Pseudomonas en het schimmelgeslacht Trichoderma, die in staat zijn tot het remmen van bepaalde schadelijke schimmels en bacteriën. Door het beënten van de bodem met zulke nuttige micro-organismen kan de bodemmoeheid worden gereduceerd. AB – Biotechnologie & Microbiologie 43 1.3.5 Bacteriën, gisten en schimmels in de voedsel- en voederproductie 1.3.5.1 Zuivelbereiding A Melk Melk, onder goede hygiënische condities uit gezond melkvee gewonnen, bevat van nature een groot aantal onschadelijke bacteriesoorten, namelijk van de geslachten Lactobacillus, Lactococcus en Streptococcus (allen melkzuurbacteriën). Onder condities die groei van de bacteriën toestaan, wordt melksuiker (lactose) vergist en treedt de bekende melkverzuring op. Als dat proces ongecontroleerd plaatsvindt, wordt de melk in het algemeen ongeschikt voor consumptie, we spreken dan van bedorven melk. Om de melk minder bederfelijk te maken, wordt deze daarom gepasteuriseerd of zelfs gesteriliseerd. Sterilisatie (sterke verhitting) is een rigoureuze maatregel met de bedoeling alle kiemen te doden. Men moet daarbij tot 120°C verhitten om ook de eventuele sporen, waarmee de melk van buitenaf besmet kan zijn uit te schakelen. Bij die hoge temperaturen verliest de melk een deel van zijn smaak en voedingswaarde. Pasteurisatie is een typische compromisoplossing. De melk wordt in dat proces gedurende korte tijd op een temperatuur van 60 tot 70°C gebracht, waardoor een sterke reductie van het aantal kiemen in de melk wordt bereikt. De duurzaamheid is ten opzichte van rauwe melk verbeterd, maar haalt natuurlijk niet die van steriele melk. Daar staat als winst tegenover dat de gepasteuriseerde melk beter op smaak en van kwaliteit blijft dan gesteriliseerde melk. B Yoghurt en kaas In de zuivelindustrie wordt (gepasteuriseerde) melk op een gecontroleerde manier met behulp van speciaal toegevoegde bacteriën (melkzuurbacteriën) omgezet tot producten als yoghurt en kaas. Men heeft in de zuivelindustrie robuuste mengsels van bacteriën tot zijn beschikking, die als 'starterculturen' bekend staan. Daarmee wordt de yoghurt- of de kaasbereiding ingezet. De stofwisselingsproducten die de melkzuurbacteriën (of andere micro-organismen, zoals de schimmels die in bepaalde kaasbereidingen worden toegepast) tijdens hun groei in de melk maken, geven aan de producten een bijzondere smaak en kunnen ook de voedingswaarde verhogen. Yoghurt ontstaat door vergisting van lactose in melk bij een temperatuur van 40°C door de melkzuurbacteriën Lactobacillus bulgaricus en Streptococcus thermophilus. Ook bij boter- en kaasbereiding speelt melkzuurgisting een AB – Biotechnologie