Méthodes D’étude des Métazoaires PDF

MATIERE: METHODES D’ETUDE DES METAZOAIRES Crédits : 5 Coefficient : 3 PARTIE -I- Méthodes Coprologiques 1- Techniques de prélèvement, de préparation et d’examen d’échantillons 1.1. Prélèvement des selles 1.2. Examen direct des selles  Examen macroscopique  Examen microscopique  Pr...

MATIERE: METHODES D’ETUDE DES METAZOAIRES Crédits : 5 Coefficient : 3 PARTIE -I- Méthodes Coprologiques 1- Techniques de prélèvement, de préparation et d’examen d’échantillons 1.1. Prélèvement des selles 1.2. Examen direct des selles  Examen macroscopique  Examen microscopique  Préparation à l’état frais en soluté physiologique  Préparation à l’état frais à l’iode (Lugol) 1.3. Techniques de concentration parasitaire  Méthodes physiques  Techniques de sédimentation o Sédimentation simple o Méthode de Faust et Ingalls en eau glycérinée  Techniques de flottation o Méthode de Willis o Méthode de Faust simplifiée o Méthode de Janeckso Urbanyi  Méthodes physico-chimiques (diphasiques) o Méthode de Teleman Rivas modifiée par Bailenger o Méthode de Ritchie o M.I.F concentration 1.4. Techniques spéciales  Technique de Kato-Katz  Technique de Baermann  Scotch-test anal Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 1  I- Méthodes Coprologiques La coprologie parasitaire est un examen de base consistant à examiner les selles sur le plan macroscopique et microscopique. Il permet le diagnostic d’un grand nombre de parasites intestinales (vers ou protozoaires) et extra-intestinaux (œufs de douves des voies biliaires voire du poumon ; œufs de schistosomes) pour lesquels les selles constituent le véhicule normal de leur forme de dissémination dans le milieu extérieur. L’examen d’un unique échantillon de selles ne détecte le parasite que dans 50 à 70 % des cas. Tandis que, si trois selles sont examinées, la fréquence d’identification augmente à 95 % ; L’Interrogation du patient Dans ce cas c’est indispensable, il précisera : - L’origine géographique du malade et/ou ses éventuels voyages ; - La date de début des troubles par rapport aux différents voyages ; - Les habitudes culinaires : cresson, viande rouge, etc. ; - Les antécédents personnels et familiaux ; - La nature des troubles motivant l’examen : troubles du transit intestinal (diarrhée, alternance diarrhée-constipation), douleurs abdominales, nausées, vomissements, prurit anal (oxyurose), larva currens (anguillulose), élimination spontanée de vers (anneaux de tænia, adultes d’oxyure ou d’ascaris) Les résultats des explorations biologiques :  l’hyper éosinophilie oriente vers une Helminthose. Généralement l’hyper éosinophilie correspond à la migration tissulaire du parasite et l’examen de selles peut être alors négatif.  l’anémie peut être due à une Ankylostomose, exceptionnellement à une Trichocéphalose. Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 2 1.1. Prélèvement des selles L’idéal serait de faire le prélèvement au laboratoire car il y a risque de s’exposer à divers inconvénients.  Faire parvenir la selle dans les délais les plus brefs.  la selle ne doit pas trop se refroidir. (Sensibilité des trophozoites au froid).  Utiliser un contenant (boite) propre, à large ouverture et à fermeture hermétique.  Eviter le contact avec l’eau, le sol et l’urine.  Mentionner sur le contenant le nom, prénom ou le numéro du malade, la date et l’heure d’émission de la selle selon les techniques de base pour le laboratoire d’après l’organisation mondiale de la santé OMS.  Conservation des selles : si le délai d’acheminement du prélèvement est long, on a recours à des méthodes de conservation par : ▪ Le froid : à +4°c, mort des trophozoites et des larves d’anguillules, et conservation de kystes de Protozoaires et œufs d’Helminthes d’après Valentin (2009).  L’eau formolée qui est une solution conservatrice mais aussi fixatrice (d’Helminthes et de kystes), à 10% pour les selles fermes, à 5% pour les selles pâteuses. Les trophozoites se fixent et se conservent pendant quelques semaines dans du formol à 10%, les œufs d’Helminthes à 20%.  Le M.I.F (Merthiolate-iode-formol) : elle permet une conservation plus longue des formes végétatives, quelques années, ainsi que les kystes indéfiniment, tout en permettant leurs observation sous forme colorée. C’est un mélange de solution mère de merthiolate, de teinture de merthiolate et de solution de lugol à 5% selon Valentin (2009). Prélèvement des matières fécales chez les animaux  Avec un gant, récupérer des matières fécales (environ 20g) de préférence directement dans le rectum ou à l’anus des animaux.  Les glisser dans le sachet fourni, après avoir rempli toutes les informations sur l’étiquette, et refermer le sachet.  Apporter les prélèvements au laboratoire et conserver les matières fécales dans réfrigérateur à 4 °C. Examen direct des selles  Examen macroscopique L’examen macroscopique renseigne sur :  La consistance des selles : les selles peuvent être moulées dures, moulées souples, pâteuses non moulées, liquides hétérogènes ou liquides homogènes, fermes en partie et très molles ou d’autres. Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 3   La couleur de la selle : jaune en rapport avec la présence de bilirubine, décolorée liée à un obstacle au niveau des voies biliaires, ou noir liée à la présence de sang digéré ou de médicament à base de charbon.  Eléments surajoutés : la présence d’anneaux de tænia, d’ascaris adultes, d’oxyures adultes et même de larves d’anguillules.  Examen microscopique L’examen microscopique est le temps essentiel de l’analyse. Il permet de dépister les œufs et les larves d’Helminthes, les kystes et les formes végétatives d’amibes et de flagellés, les oocystes de coccidies et les spores de micro sporidies. L’examen à l’état frais : Il permet de voir la mobilité de certains parasites et donne une idée sur le degré d’infestation du patient (Selon la qualité des prélèvements et la consistance des selles).  Préparation à l’état frais en soluté physiologique L'examen direct est le seule examen qui permet d’apprécier la vitalité des parasites. Il met en évidence les kystes et les formes végétatives de protozoaires ainsi quelques œufs et les larves d'helminthes.  Principe Une noisette de selle (Différents endroits) ˖ L’eau physiologique à 0.9% Suspension homogène 2 gouttes sur une lame, recouvrir par une lamelle Lecture en zigzag x10 /x 40 Diluer dans un verre à pied, la selle avec de l’eau physiologique à 9‰ (une noix de selle prélevée à différents endroits avec environ 10 fois son volume d’eau). Etalonnée une goutte de cette dilution sur lame afin qu’elle soit prêt pour l’analyse microscopique. Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 4   Préparation à l’état frais à l’iode (Lugol) On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les structure nucléaires Quelque soit le résultat de l’examen direct on doit obligatoirement le compléter par deux techniques de concentration l’une pour les kystes et l’autre pour les œufs. 1.3. Techniques de concentration parasitaire Les techniques de concentration sont indispensables, et doivent être faites systématiquement. Elles permettent d’isoler avec un minimum de résidus un nombre maximum de kystes et œufs d’Helminthes  Méthodes physiques Basées sur la différence de densité existant entre le réactif diluant et le parasite (Sédimentation Ŕflottation). Les selles diluées dans un réactif de densité différente de celle de parasite DR supérieur DP = flottation DR inferieur DP = sédimentation  Techniques de sédimentation (qualitative) o Sédimentation simple Elle peut être réalisée seulement à l’eau de robinet, pendant 1h de sédimentation, a répétée jusqu’à limpidité du surnageant o Méthode de Faust et Ingalls en eau glycérinée Réalisée en utilisant l’eau glycérinée (Eau + Glycérine à 0,5%), elle permet d’augmenter la mouillabilité qui facilite la sédimentation des parasites : larves Anguillules, Œufs d’Ascaris non fécondés et œufs de Schistosoma mansoni.  Techniques de flottation (qualitative) La méthode de flottation utilisée au laboratoire de Parasitologie, une technique qualitative qui permet d’identifier les éléments parasitaires. L’utilisation d’une solution saline a densité supérieure aux œufs de parasites permet de faire remonter les œufs vers la surface et d’entraîner les débris vers le fond. Plus la salinité de la solution, meilleure est la sensibilité pour détecter des œufs Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 5  o Méthode de Willis (1921) Mode opératoire :  Diluer 10 g de selle dans100ml de la solution saturée de Nacl à 25% (25 g dans 1000 ml  Homogénéiser le prélèvement au moyen d'un mortier et d'un pilon.  Filtrer le mélange sur une passoire à thé sous laquelle on a pris soin de déposer un récipient.  Remplir complètement un tube à essai avec le liquide filtré jusqu'à formation d'un ménisque convexe.  Crever les bulles d'air à la surface.  Recouvrir le ménisque d'une lamelle sans emprisonner de bulles d'air.  Attendre 15 minutes et retirer la lamelle à la face inférieure de laquelle se sont accumulé les œufs.  Poser la face inférieure de cette lamelle sur une lame porte objet.  Identifier les œufs par observation microscopique Remarque Cette technique est appliquée à la rechercher des œufs d’ankylostomes et d’ascaris fertile et contre indiquée aux larves, kystes, œufs douves, schistosomes o Méthode de Faust simplifiée (1930)  Diluer soigneusement 10g de selles dans 100ml d’eau tiède dans un verre conique.  Tamise avec de la gaze humide disposée dans un entonnoir qui plonge dans un tube à centrifuger.  centrifuger à 1500 t/m et on rejette le surnageant et on remet le culot en suspension dans d’eau.  On répète l’opération 3à4 fois jusqu’à ce que le surnageant soit limpide,  on remet alors le culot en suspension dans le sulfate de Zink So4Zn à 33%( 33g de So4Zn dans 100ml eau distillée).  centrifuger 1minute /1500, on prélève à l’anse de platine la pellicule de surface qu’on examine au microscope. Remarque Cette technique peut déformer les kystes de protozoaires Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 6  o Méthode de Janeckso Urbanyi(1931)  Utilise comme réactif une solution de domercurate de potassium ( d=1.14), qui doit être manipulée avec prudence Iodo-mercurate de potassium: Bi iodure de mercure 100g Iodure de potassium 74g Eau distillée 50 ml.  Diluer3à5g de selles dans une solution iodo-mercurique  Tamiser dans un tamis métallique de 1mm de mailles  Centrifuger 3ml à 2500T/Mn  Recueillir la partie superficielle avec anse de platine  Mettre le prélèvement entre lame et lamelle  Observe immédiatement (avant l’altération des œufs) Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 7   Méthodes physico-chimiques (diphasiques) Caractérisées par la mise en présence de deux phases non miscibles : l’une aqueuse et l’autre constituée par l’éther qui est un solvant des lipides. Il se crée un coefficient de partage entre ces deux phases et la répartition de chaque élément fécal dans chacune d’elles sera isolés en fonction de son pouvoir hydrophile ou lipophile. Bailenger a montré que le pH de la solution était l'élément déterminant pour la plus ou moins grande efficacité d'une technique selon le parasite recherché. Principes théoriques  Les selles triturées dans la solution choisie formol 10٪  elle peut être préalablement passée sur un tamis pour éliminer les gros débris le filtrat est versé dans un tube à centrifuger à fond conique en le remplissant 1/3 d'éther de manière à ce qu'il y ai 2/3 du mélange selle , en laissant 1 cm pour fermer le tube.  L’agiter pendant une minute  La suspension éthéro-liquide obtenue est centrifugée à une vitesse lente de l'ordre de 1500 à 2000 tours/minute pendant une à trois minutes.  Après centrifugation, les constituants de la suspension sont répartis en quatre Couches  Décoller la couche des résidus lipophiles à l'aide d'une baguette de verre.  Retourner le tube au-dessus de l'évier (en faisant couler de l'eau) ou d'un bac à déchets liquides.  Essuyer les parois du tube avec un coton tenu à la pince en laissant toujours le tube avec l'ouverture dirigée vers le bas pour éviter de souiller le culot avec les résidus.  Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique (L’eau physiologique) pour remettre en suspension le culot qui sera examiné.  le culot qui nous intéresse contient les éléments parasitaires (kystes des protozoaires)  o Méthode de Teleman Rivas modifiée par Bailenger  Triturer dans un verre à pied conique 2à5g des selles dans 10fois de leur volume dans du tompon acéto-acétique à PH 5,5.  Laisser sédimenter 40 à 50 secondes.  Verser le liquide surnageant dans un tube à centrifuger.  Ajouter de l’éther sulfurique (1 :3 du volume totale du liquide) en prenant la précaution de laisser au moins un centimètre de hauteur vide dans le tube  Agiter vigoureusement jusqu’à émulsion complète après avoir bouché le tube avec le pouce.  Centrifuger immédiatement après l’émulsion 1minute e ntre 1500à2000t.  Jeter le surnageant et prélever le culot par capillarité avec une pipette de pasteur. Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 8 Cette méthode reste une bonne technique de routine avec une petite réserve en ce qui concerne les œufs légers (Ankylostomes, et Douves en particulier). Cette technique concentre bien : les les kystes( Giardia, amibes) et les Œufs ( Trichocephale, et ankylostome) ainsi que les oocystes de cryptosporidies. Solution de Bailenger Acétate de sodium : 15 g Acide acétique : 3,6 ml Eau distillée : Qsp 1000 ml Ajuster à pH5 avec acide acétique ou soude diluée, à l'aide d'un pH-mètre. o Méthode de Ritchie simplifiée  Avantages Cette méthode peut être utilisée sur les selles formulées donc sur des sellescollectées pour enquêtes épidémiologiques. Elle concentre bien les œufs d'ascaris etde schistosome.  Inconvénients Le culot souvent volumineux est de lecture difficile.  Déroulement de la technique Mis à part le liquide de dilution, la technique est la même que pour laconcentration de Teleman-Rivas. Solutions de Ritchie Eau chlorurée sodique à 9 % Réactif de Ritchie (100 mL de formol, 9g de NaCl, 900 m L d'eau distillée Eau formulée à 10 % (formol officinal)  Principe technique Cette technique permet d'augmenter la sensibilité de la recherche de formes kystiques ou d'oeufs Les formes végétatives ne peuvent plus être mises en évidence après concentration Les œufs d'Ascaris sont détruits par cette méthode ;  Reactifs Solution de formol à 10% et solution d'ether éthylique. Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 9  La technique  Diluer une noisette de selles dans l'eau formolée à 10%.  Tamiser à l'aide d'une passoire avec des pores fins.  Ajouter un volume égal d'ether.  Emulsionner par agitation vigoureuse.  Centrif. à 1500 t/min pendant 2 mn dans tube à fond conique.  Rejeter le surnageant.  Examiner le culot entre lame et lamelle aux G. 100 et 400 o MIF concentration  La technique  Mélanger dans un flacon bien bouché une partie des selles pour 10 parties de solution MIF (Merthiolate, Iode, Formol)  Bien agiter  Faire un examen direct : prendre une goutte de la solution obtenue après mélange et examiner entre lame et lamelle.  Si l’examen direct est négatif  Mélanger a nouveau en agitant le flacon  Laisser décanter  Verser le surnageant dans un tube à centrifuger.  Ajouter l’éther sulfurique (1/3) en prenant la précaution de laisser au moins un centimètre de hauteur vide dans le tube.  Agiter vigoureusement jusqu'à émulsion complète après avoir bouché le tube avec le pouce  Laisser décanter 2 min environ. L’émulsion doit rester stable.  Centrifuger immédiatement après l’émulsion pendant une minute à 2000 t.  Jeter le surnageant et prélever le culot par capillarité avec une pipette pasteur. Cette technique permet d'augmenter la sensibilité de la recherche de formes kystiques ou d'oeufs.Les formes végétatives ne peuvent plus être mises en évidence après concentration Préparation de M.I.F. Solution: mélanger 0.25 ml de Lugol's solution, M.I.F.et 3 ml of M.F. Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 10 1.4. Techniques spéciales  Technique de Kato-Katz C’est une technique de décoloration des selles qui permet de distinguer rapidement au faible grossissement les œufs de parasites dans une préparation de delle rendue translucide.  Réactif Glycérine 100ml, Vert malachite à 3٪ 1ml, Eau distillée 100ml.  Technique  Découper des lamelles de cellophane en rectangles de 2à3 cm  Les rectangles de cellophane doivent séjourner au moins 24heures dans la solution  Méthode qualitative :  Un petit poids de matières fécales (environ 30mg) est déposé sur une lame de microscope ordinaire puis étalé sous forme de frottis épais. Celui-ci est recouvert d’un rectangle de cellophane imprégné de la solution.  La préparation est retournée puis écrasée sur une feuille de papier absorbant.  Les lames sont conservées de 15 à 30 Minutes à la température de laboratoire avant d’être examiné  Technique de Baermann Elle utilise un appareillage simple constitue par un entonnoir de12cm d’ouverture et dont la tubulure porte un tube en caoutchouc fermé par une pince.  mettre environ 15g des selles fraiches dans une passoire métallique tapissée selon la consistance de la selle par une ou deux couches de gaz.  remplir l’entonnoir jusqu’au 1/3 de la hauteur de l’eau chaude( 45°)  placer dans l’entonnoir la passoire contenant la selle dont la partie inferieure doit affleurer l’eau.  2à3 heures plus tard retire du dispositif le liquide qui pourra être soit centrifugé à1500T/mn pendant 5minute et permettre l’examen du culot au microscope, soit vidé dans une boite de pétri et examiné à la loupe binoculaire. Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 11   Scotch-test anal C’est une technique biologique basée sur le cycle de l’oxyure, les femelles d’oxyures pondent leurs œufs à la marge anale après avoir forcé le sphincter anal, donc on retrouvera les œufs au niveau des plis autour de l’anus.  Le prélèvement se fera le matin avant toute toilette et avant la défécation car les femelles pondent surtout la nuit. Donc pour la mise en évidence de leurs œufs, on effectue ce test.  La lecture se fait directement sous microscope avec l’objectif x10. Cette technique détecte bien les œufs d’oxyures et les anneaux de Teania saginata. Module : Méthodes d’étude des métazoaires - 1- Méthodes Coprologiques 12