Toxicologie Uitwerking Assignment 1 PDF

🙆🏼‍♂️ Toxicologie Uitwerking artikel assignment 1 College 1: Drug safety Sciences Dosis bepaalt of iets farmacologisch of toxisch is. → Concentratie afhankelijk effect van het geneesmiddel. —> Acute (bv. overdosis...

🙆🏼‍♂️ Toxicologie Uitwerking artikel assignment 1 College 1: Drug safety Sciences Dosis bepaalt of iets farmacologisch of toxisch is. → Concentratie afhankelijk effect van het geneesmiddel. —> Acute (bv. overdosis) en chronische (langdurig gebruik) toxiciteit kunnen een verschillend effect geven. Adversed drug reaction (AD)= wanneer het nemen van een medicijn zorgt voor een ongewilde, vaak negatieve reactie, in het lichaam. Mogelijke interacties tussen geneesmiddelen kan leiden tot ongewenste bijwerkingen; kan erin resulteren dat andere geneesmiddelen niet meer werken. Anti-kanker geneesmiddelen maken tumor cellen dood → hoge dosis vergroot de kans dat gezonde cellen dood gaan. Bij fatale ziektes accepteer je meer bijwerkingen. Immuno-suppressiva= wordt gebruikt na een transplantatie om je immuunsysteem te onderdrukken. Small molecules= chemische structuren die bv precies op de receptor passen Toxicologie 1  Biologics= antilichamen Biologics hebben over het algemeen minder ongewenste bijwerkingen. Redenen voor het mislukken van medicijnontwikkeling: effectiviteit toxicologie commercieel → wordt het verkocht? strategie PK/bio beschikbaarheid anders Classificatie van mechanismes die zorgen voor toxiciteit Drug metabolisme routes zorgen ervoor dat het geneesmiddel beter wateroplosbaar wordt, zodat het lichaam het kan uitscheiden. Drug metabolite I: hydrolyseren, oxidatie, reductie. Drug metabolite II: verdere modificatie, zet er bv een suiker of fosfaat groep op. → heeft effect op acute, midterm of lange termijn. Toxicologie 2  Aan de hand van genexpressie en mitochondriale energie kunnen afleiden wat leidt tot toxiciteit. Bepaling van de toxiciteit: Frequentie/heftigheid van AD= F1 (drug) + F2 (chemistry drug) + F3 (individueel) kwalitatieve en kwantitatieve factoren die bijwerkingen van geneesmiddelen bij mensen bepalen: Dosis: NOEL = no observable effect level → laagste dosis waar geen effect is gemeten. NOAEL = no observable adverse effect level → laagste dosis waarbij geen toxisch effect is gemeten. LOAEL = lowest observed adverse effect level → dit wil je niet! LD50 = Dosis waarbij 50% van de geteste organisme sterven. —> LD50 hoger dan de LOAEL TD50 = Dosis waarbij 50% van de geteste organisme toxiciteit laat zien. TC50 = concentratie waarbij 50% van het test systeem toxiciteit ondergaat. → in vitro spreek je nooit over een dosis, maar over een concentratie. Nicotine bindt aan een receptor en heeft dus een fysiologisch effect. Bij hoge dosering kan het leiden tot de blokkering van spierweefsel. Door de specifieke binding aan de receptor leidt het tot toxiciteit, want een hoge dosis resulteert in een inhibitory effect. Hogere affiniteit voor een specifieke receptor → kleinere dosering nodig dat leidt tot toxiciteit Niet alleen chemische structuren leidde tot toxiciteit, maar bv. ook eiwitten. Proberen het gevaar te en het risico tot toxiciteit te herkennen. Chemische structuur: als het geneesmiddel ook aan andere receptoren bindt → selectiviteit Promiscuous: het geneesmiddel heeft een interactie met meerdere targets. Als iets niet selectief is wordt het medicijn niet verder ontwikkeld, want kan leiden tot toxiciteit. Toxicologie 3  Biologie: gevoeligheid en de genetische variatie onderling College 2: Nephrotoxicity Nephrotoxicants= stoffen die schadelijk zijn voor de nier. Veroorzaken geneesmiddel-geïnduceerde nier toxiciteit (gem-ind). Nieren= belangrijk voor het scheiden van chemische stoffen, het wordt gefiltreerd. Redenen dat de nier gevoelig is voor toxiciteit: 25% van bloed afkomstig van het hart gaat naar de nier. Ze filteren grote hoeveelheden plasma Er wordt perurine gemaakt; het is erg actief in het transport van nutriënten en water. Glucose wordt bv. voor 100% weer geabsorbeerd. Preklinische screening op nephrotoxicity is niet gevoelig genoeg. → Screening op nier toxiciteit moet strenger worden uitgevoerd tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen om latere klinische mislukkingen van geneesmiddelen en patiëntmorbiditeit te verminderen. —> biomarkers die in een vroeg stadium al schade aan de nier kunnen detecteren. Veiligheid is een probleem dat resulteert in geneesmiddel mislukking. Dit neemt af naarmate je verder bent in de klinische fase. - Klinische falen groter dan preklinische falen, omdat een proefdier niet kan zeggen hoe die zich voelt. → het probleem is vaak de stof en niet de target. Opbouw van de nier: Cortex= buitenkant van de nier. Medula= binnenkant van de nier. Glomerulus= bevinden zich in de cortex en filteren het bloed. Nephron= Kleinste functionele unit van de nier. Hier komt het gefiltreerde bloed als voorurine. Collectieve tubulus= hier komt het voorurine terecht via de distale tubulus. Toxicologie 4  Alle cellen langs de tubule hebben een andere functie. Toxische stoffen kunnen verschillende onderdelen van de nier aantasten: Vasculair systeem: - belangrijk voor toevoer van zuurstof en renale functie (essentiële taken). - geneesmiddelen kunnen de renale bloed flow verstoren, wat resulteert in Ischemic. Afname aan zuurstoftoevoer → minder ATP → cellen kunnen minder goed filtreren. - kan celdood veroorzaken Nephron; filtrerende, transporterende en concentrerende eigenschappen van de nephron zijn kwetsbaar voor toxische stoffen. Geneesmiddelen kunnen AKI (acute nier schade) en CKD (chronische nierziekte) veroorzaken: 1. Acute kidney injury (AKI)= Nier schade die leidt tot een plotselinge (minuten tot dagen) afname van de nierfunctie. - Gemeten aan de hand van verhoogde serum- of plasmacreatinine of ureum (BUN, bloedureumstikstof). → Wanneer de nier niet goed werkt worden deze stoffen niet uitgescheiden via de urine, maar stapelt het zich op in het bloed plasma. Wordt vaak geassocieerd met de dood van tubulaire epitheelcellen. → kan door een korte blootstelling of een aantal dagen → afhankelijk van de toxiciteit van de stof (hoge dosis eerder effect). Oorzaken van AKI: Hypoperfusie van de nieren (hartfalen, niertransplantatie, verschillende soorten trauma, sepsis). → te kort aan zuurstof → geen ATP → cellen gaan dood Nefrotoxische schade Het risico is verhoogd bij patiënten met bestaande chronische nierschade (CKI, ongeveer 7% van de bevolking) Toxicologie 5  AKI leidt vaak tot permanenten defecten aan de nier functie, de nier herstelt vaak niet volledig. Sterfte aan AKI is afhankelijk van leeftijd, beschadiging etc. Mechanisme van chemisch geneesmiddel-geïnduceerde acute renale falen: Pre-renaal: de constrictie van vaten nemen af, hierdoor neemt ook de bloeddruk af, waardoor er minder perfusie is in de nier en dus ook minder zuurstof. Vasoconstrictie: zorgt voor minder zuurstoftoevoer. Kristalvorming: zorgt voor verstopping van de buis van de proximale tubulus, hierdoor kan het pre-urine niet doorstromen. Tubulaire toxiciteit: wanneer proximale tubulus cellen doodgaan dan ontstaan er gaten in de proximale tubulus. Endotheel schade: de endotheelcellen van de bloedvaten die rondom de tubulus zitten raken beschadigd, hierdoor is de nier minder goed doorbloed Schade aan de glomerulus: vaak door een ontsteking die ontstaat door een ophoping aan stoffen. Ontsteking rondom het nefron: ontstaat door immuun cellen Meerdere redenen die kunnen leiden tot AKI, er zijn drie klassen: Pre-renal: gebeurtenissen die gebeuren die resulteren in nierfalen, zoals verstoring in de bloeddruk. Intrinsic renal: wat er in de nier zelf gebeurd, bv. door ontstekingen Ischemic= te kort aan zuurstof Post-renal: afname in bloedstroom of verstopping van de blaas. Toxicologie 6  2. Chronic kidney disease (CKD)= nierfunctie gedurende maanden of jaren geleidelijk afneemt. CKD wordt gekenmerkt door structurele of functionele schade aan de nieren, vaak gepaard met een blijvende vermindering van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) totale hoeveelheid bloed wat gefiltreerd kan worden door de glomerulus in alle nieren per minuut). Kan ontstaan doordat de AIK niet volledig is herstelt of door langdurig gebruik van een geneesmiddel. Prognose: Veelvoorkomende complicaties van CKD zijn hypertensie, anemie en stoornissen in het mineraalmetabolisme, die kunnen leiden tot botziekten en vasculaire calcificaties. GFR wordt bepaald door: hoeveelheid bloed dat gefilterd wordt door al je nephronen en wordt geklaard. → bloed flow Adequate filtratie druk; hoge bloeddruk voor goede filtratie Glomerulaire permeabiliteit beperkte intratubulaire druk Oorzaken voor het verlies van GFR: Afferente arteriolaire vernauwing → kan minder bloed langs (minder doorstroming), minder klaring Buisvormige obstructie: door bv. kristalvorming is er opstopping waardoor het pre-urine er niet door kan en er druk tegen het filter ontstaat → er wordt minder gefilterd. Tubulaire backleak; Lekkage doordat proximale tubulus cellen doodgaan en al het pre-urine weer terug in het lichaam kan stromen. Toxicologie 7  —> Schade of verstoring van de fysiologie in het nephron zorgt ervoor dat de GFR afneemt. Fysische chemische eigenschappen van het geneesmiddel vergroten de kans op nephrotoxicity: Lading → Het membraan van de glomerulus heeft een lading, geladen stoffen kunnen een verstoring veroorzaken. - Opname van pro-urine door lading selectieve transporteiwitten, waardoor cytoplasmatische accumulatie ontstaat. - Opname uit interstitiële vloeistof voor transepithelial secretie Eiwitbinding - Covalente binding van reactieve intermediëren aan eiwitten (voornamelijk in de proximale tubulus cellen) - Binding van metalen aan metallothionine in de lever, het metaal cadmiun wordt opgenomen in de lever en bindt aan eiwit metallothionen. Dit complex komt uiteindelijk bij de nier en wordt herkend als eiwit en opgenomen door de proximale tubulus cellen. Dit zorgt voor opstapeling van cadmiun in de proximale tubulus cellen. Molecuul grootte → het moet door het filter kunnen, anders vindt er opstapeling plaats van bv. antilichamen en dat kan een ontsteking veroorzaken. Oplosbaarheid → meeste geneesmiddelen zijn hydrofoob. Als ze heel hydrofiel zouden zijn zouden ze zich snel in het urine bevinden. - wanneer stoffen slecht oplosbaar zijn en in hoge concentratie voorkomen kunnen ze kristallen vormen → tubulus obstructie. Belangrijkste type nier toxiciteit schade zijn Proximale tubulaire schade en distaal tubulaire schade, gerelateerd aan de renale cellen. Redenen voor belangrijkste target. Toxicologie 8  Redenen dat proximale tubulaire cellen een belangrijk target zijn voor toxiciteit: 1. Hoge transportcapaciteit → de proximale tubulaire cellen hebben de belangrijkste functie van transport van o.a. glucose, zouten en lichaamsvreemde stoffen in/uit de voorurine. 2. Hoge ATP omzet → transport kost heel veel energie. Het moet tegen een concentratiegradiënt transporteren. 3. Heel veel mitochondria in de proximale tubulaire cellen → door de hoge behoefte aan energie. Via zuurstof maken ze dus ATP aan (oxidatieve fosforylering) en NIET via glucose. 4. Medicijn metabolisme vindt plaats in de tubulaire cellen → namelijk fase 1 & 2 (dus het hydrofieler maken van het geneesmiddel om ze zo beter uit te kunnen scheiden. Er zijn veel transporters die bijdragen aan het klaren van het bloed. Proximale cellen heb je veel transporters. Basaal membraan= aan de kant van het bloed. Apicale zijde= aan de kant van het urine. → glucose transport bevindt zich aan de apicale zijde, moet weer terug naar het bloed. —> afhankelijk van waar je stof naar toe moet aan die zijde zit de stof. Verschillende klassen transporteiwitten: Influx vs efflux (in en uit de cel) Excretie vs absorptie (in en uit een orgaan) Passieve transporteiwitten= moleculen gaan met het elektrochemisch gradiënt mee en verbruikt geen ATP. Actief transporteiwit= werkt tegen het elektrochemisch gradiënt en kost ATP. Secundaire actieve transporteiwitten= hydrolyseren het ATP niet zelf maar gebruiken ion gradiënt geproduceerd door primaire actieve eiwit transporters. Firma voor een vergroting van de oppervlakte en zo kunnen zich er meer transporters op plaats vinden. Toxicologie 9  Transporteiwitten zijn normaal betrokken bij het uitscheiden van afvalstoffen en de heropname van bouwstenen, maar kunnen ook geneesmiddelen herkennen en deze uitscheiden. → kan ervoor zorgen dat het geneesmiddel zich opstapelt in de proximale tubulus. → schade in de cellen. (bijvoorbeeld bij cysteine) Voor sommige chemische stoffen zitten er enzymen in de proximale tubulus cellen die het conjugaat kunnen activeren in een reactief metaboliet → kan schade veroorzaken. (bijvoorbeeld bij aminoglycoside) —> consequenties van proximale schade en dood: tubulaire klustering formatie Dode van proximale tubulus cellen laten zich los van het membraan en klusteren samen → cast formation → in de tubuli kan door die cast formation niks meer door stromen. Afhankelijk van de basis van de schade kies de cel er voor om het te herstellen of apoptose in te zetten. → als het niet kan regenereren behoud je blijvende schade Heeft effect op de beschadigde en onbeschadigde cellen; onbeschadigde cellen moeten meer delen om de dode cellen te vervangen. De beschadigde cel scheiden ook signalen uit voor het immuunsysteem om de schade op te ruimen Te veel reactie van het immuunsysteem kan bijdragen aan nierfalen → kan namelijk zorgen voor ontstekingen. Klassieke biomarkers: Meetbare indicatoren van biologische processen op een behandeling. Identificeren geen nier schade in een vroeg stadium, omdat we 50% van onze nierfunctie kunnen missen. Er zijn gevoelige biomarkers nodig voor renale schade. (Pre) -klinische identificatie door geneesmiddel geïnduceerde nier toxiciteit: Asymptomatisch Bij de mens verhoogde ureumstikstof in het bloed (BUN) en creatinine, aanwezigheid van bloed, eiwit of kristallen in de urine Toxicologie 10  Bij proefdieren ook door histologie en immunohistochemie Het gebrek aan gevoeligheid van deze tests is een groot probleem voor klinische geneesmiddelen ontwikkeling! Evaluatie van nier toxiciteit in niet/preklinische studies: Niet-klinische toxicologische onderzoeken kunnen toxiciteit identificeren voor het gebruik van het geneesmiddel door patiënten Zorgt voor verdere studies - met name histopathologie De mate van niet-klinische toxiciteit kan leiden tot beëindiging, medicijnoptimalisatie of verhoogde waakzaamheid in vroege klinische studie Als klinische tests doorgaan, kunnen niet-klinische resultaten aangeven welke regio aansprakelijk is tot verwonding - b.v. hemodynamisch of buisvormig Soorten geneesmiddel geïnduceerde nier toxiciteit en detectie van renale schade: Vasculaire ziekte Glomerulaire nefropathie Tubulaire necrose Interstitiële nierontsteking → Zorgen allemaal voor een afname in de GFR en zorgen voor verandering in creatine en BUN bij heftige beschadiging van de nier → Je wilt biomarkers die ook aangeven waar precies schade is in de nier, om zo meer mechanistisch inzicht te krijgen op de nier toxiciteit In verschillende regio’s van de nier zitten verschillende eiwitten die kunnen worden gebruikt als biomarker. Voorbeelden van biomarkers: KIM-1: marker voor proximale tubulaire schade, uitgedrukt op differentieerde epitheelcellen. Werkt niet in vitro. Gamma glutamyl transpeptidase (GGT): marker voor acute (proximale) tubulaire schade. Het bevindt zich op de vili. Het is minder gevoelig dan KIM- 1. Toxicologie 11  Cystain-C: marker voor schade aan de glomerulus (verlies in GFR) en proximale tubulaire schade. Het detecteert een snelle afname in GFR. Glomerulus dient als een filter waardoor grote eiwitten in het bloed blijven → bij schade ontstaan er gaatjes waardoor deze eiwitten (zoals Cystrain-C) wel in het urine komen. Daarnaast konden de proximale tubulus het niet heropnemen, dus hier is ook schade aan. College 3: lever toxiciteit Structuur en functie van de lever De lever bestaat uit 4 kwabben die van zuurstofrijk bloed worden voorzien door de leverslagader (hepatic artery) vanuit de centrale bloedsomloop en de leverpoortader (hepatic portal vein) vanuit de maag/darm/milt/alvleesklier, met een laag zuurstofgehalte en voedingsstofrijk. Leverader (hepatic vein)= zuurstofarm bloed vanuit de lever wordt afgevoerd naar de grote bloedsomloop richting vena cava inferior. Gal= wordt geproduceerd door de hepatocyten. Het wordt afgevoerd via de galwegen naar de galblaas (bile duct). De lever bestaat uit veel zeshoekige lobuli (leverkwabjes). In het midden bevindt zich het centralobulaire adertjes die uitkomen in de centrale leverader, het zuurstofarm bloed vanuit de lobuli wordt afgevoerd. Op iedere hoek van de lobuli lopen vertakkingen van de poortader, leverslagader en galweg. Zonatie= verschillende zones van een lobuli, waarin hepatocyten meer of minder zuurstofrijk of voedingsstofrijk bloed tot hun beschikking hebben. Toxicologie 12  Celtype binnen de lever Lever sinusoïde= bloedkanaaltje tussen een laag van hepatocyten. Worden bekleed met endotheelcellen. Space of Disse= ruimte tussen de hepatocyten en de endotheellaag. Hierdoor kan er een uitwisseling ontstaan van moleculen en vloeistoffen tussen de sinusoïde en hepatocyten. Stellaat cellen= voor de opslag van vitamine A en kunnen bij activering van collageen een extracellulaire matrix aanmaken. Kupffer cellen= bescherming tegen bacteriële of virale infecties en ruimen celdebris en lichaamsvreemde deeltjes op. Niet-parenchymale cellen= de endotheel, stellaat en Kupffercellen samen. Bile canaliculi= verbindingsstukjes tussen de hepatocyten, deze transporteren galzouten met daaraan gekoppeld stoffen die uitgescheiden moeten worden via de gal naar de bile duct. Toxicologie 13  Hepatocyten= hebben metabole functies en bevatten daarom ook veel mitochondria. Ook moeten ze veel eiwitten aanmaken zoals albumin en bevatten dus veel ruw endoplasmatische reticulum om dit te kunnen uitvoeren. Functies van hepatocyten zijn: 1. Ontgiften door middel van fase-I en -II enzym reacties 2. Synthese van vetzuren 3. Synthese van galzuren 4. Synthese van eiwitten zoals albumine 5. Omzetting van koolhydraten naar vetten Fenestrea= kleine poriën in de laag van leversinusoïde endotheelcellen. Zo kunnen kleine moleculen door de laag heen en de hepatocyten bereiken. Redenen voor toxiciteit in de lever: Hoge bloedtoevoer First-pass-effect; na de opname in de darmen zal het medicijn voor het eerst de lever passeren via de poortader. Biotransformatie door middel van fase-I tot fase-III metabolisme Hoog zuurstofverbruik door mitochondriën Excretie van endogene toxische stoffen Lever toxiciteit De lever is een van de belangrijkste organen waar toxiciteit kan optreden in preklinische studies. → omdat het een van de eerste organen is waar het geneesmiddel langs komt (first-pass effect) en vanuit meerdere kanten komt bloed naar de lever, hoge bloedtoevoer. Stof-geïnduceerde lever schade en de ontwikkeling van bijwerkingen zijn Toxicologie 14  belangrijke factoren om de ontwikkeling van een geneesmiddel te stoppen. Deze bevindingen worden vooral gedaan in de eerste fase van het geneesmiddelen onderzoek (43%). Typen pathologie in de geneesmiddel geïnduceerde lever toxiciteit: Necrosis: niet geprogrammeerde celdood van hepatocyten. Cholestatis: opstapeling van galzouten. Sinusoidal schade: schade aan de endotheelcellen door een blokkade in de bloed flow. Hierdoor kunnen hepatocyten afsterven door een gebrek aan zuurstof. Een vermindering in deze cellen zorgt ervoor dat bij een hoge dosis toxiciteit kan optreden. Steatosis: vervetting (ophopen va vetten) van de lever. Fibrosis en cirrhosis: overmatige toename van hoeveelheid bindweefsel en collageen in de lever wat de functie van de hepatocyten kan verminderen. Enzym inductie: hoeveelheden van type enzymen in de lever veranderen van de normale situatie, hierdoor kunnen bepaalde lichaamsvreemde stoffen moeilijker worden afgebroken aangezien het enzym wat er is er in mindere mate is. Bij een hoge dosering kan dit toxische effecten hebben. Ontstaan van kanker: chronische lever aandoening. Ontstekingsreactie: een overmatige ontstekingsreactie kan zorgen voor het ontstaan van veel bindweefsel in lever. Idiosyncratische toxiciteit First pass effect= vanuit de darmen komt de lichaamsvreemde stof in de lever via de poortader. Het grootste gedeelte van het metabolisme vindt plaats in de lever door hepatocyten. Het geneesmiddel wordt omgezet naar een vorm dat minder toxisch is en om de uitscheiding te bevorderen. Verschillende fases van de metabolisme: Fase 1 metabolisme; stoffen worden chemisch gewijzigd door enzymen zoals cytochroom P450, minder toxische vormen maken (detoxificatie). → kunnen echter ook toxische metabolieten ontstaan in de lever tijdens de biotransformatie met deze enzymen. Dit noem je bioactivatie; meer toxisch dan de originele stof. Er ontstaan reactieve metabolieten die een interactie aan kunnen gaan met macromoleculen bv. eiwitten en DNA → leidt tot cytotoxicity, hypersensitiviteit; haptens (binden Toxicologie 15  aan een antigen wat leidt tot een immuunrespons) (eiwit modificatie) en kanker (schade aan DNA). De metabolieten zijn dosis en reactiviteit afhankelijk. - Fase 2 metabolisme; stoffen worden verwerkt door conjugatiereacties met endogene stoffen, zorgt ervoor dat het beter wateroplosbaar is en makkelijker kan worden uitgescheiden. Acute levertoxiciteit Acute levertoxiciteit= treedt binnen een aantal dagen op. Twee types geneesmiddel geïnduceerde levercel dood (cytotoxicity) zijn apoptose en necrose. Belangrijkste verschillen: Apoptose is afhankelijk van de activering van bepaalde signalering pathways en necrose is hier onafhankelijk van. Apoptose is energie afhankelijk en necrose niet. Bij apoptose ontstaan er apoptotische lichamen, kleine blaasjes met cel inhoud en bij necrose valt het membraan uit elkaar en valt alle inhoud van de cel naar buiten → meer immuunreacties, dus necrose leidt tot meer schade. Soorten acute lever toxiciteit: 1. Levercel necrose: Directe cel schade van hepatocyten door covalente binding van stoffen/metabolieten aan cellulaire targets, zoals DNA en eiwitten. Necrose van hepatocyten door bijv. tetrachloride (CCL4) en paracetamol → veroorzaak necrose in zone 3. —> Meer schade in zonde 3 door de afname van het zuurstofgehalte (van slagader naar ader) en de actieve CYP enzymen die verantwoordelijk zijn voor de vorming van toxische metabolieten, die in andere zones minder of niet worden gevonden. - De mate van schade en de duur van de aanwezigheid van de toxiciteit Toxicologie 16  bepaalt of een lever zich weer kan herstellen → regeneratie De lever is een zeer regeneratief orgaan. - Bij inhibitie van de cel proliferatie wordt de toxiciteit verhoogd, omdat het regeneratie proces wordt verstoord. 2. Levercel apoptose: Directe cel schade van hepatocyten door binding van metabolieten aan het DNA, wordt vooral geïnduceerd bij DNA-schade → p53 wordt geactiveerd → apoptose vindt plaats. Het is een manier van zelfbescherming. - Acetylaminofluorene (AAF) zorgt voor apoptose in zone 1 hepatocyten. 3. lever cel steatose: de stapeling van vetten in levercellen, dus gewijzigde vetzuur metabolisme in hepatocyten. De vetzakjes in de hepatocyten nemen enorm toe, de cellen vinden dit niet fijn maar ze gaan niet dood. Witte delen zijn de vetzakjes. - De oorzaak hiervan zijn geneesmiddelen (zoals valproic zuur) en verhoogd alcohol verbruik. Mechanisme: Valproic acid wordt omgezet door CYP naar een metaboliet (4VPA) → Dit metaboliet bindt in de mitochondria met CoA → CoA kan niet aan de vetzuren binden en hierdoor kunnen de vetzuren niet verbruikt worden → Vetzuren stappelen op in de levercellen. Toxicologie 17  —>lever kan herstellen na blootstelling, maar langdurige blootstelling kan leiden tot een chronische ziekte, wordt niet meer herstelt → functie van de lever gaat achteruit. 4. lever cel cholestase: Opstapeling van galzouten. Oorzaak: transporters van de galzouten worden geïnhibeerd of de cellen in de galkanalen worden geprofileerd, dit zorgt voor ontstopping in de bile caniculi. → levert schade op aan de hepatocyten. —> cholestase is schadelijker dan steatose. Chronische levertoxiciteit Chronische levertoxiciteit= Treedt op na langdurig gebruik van een stof. Soorten chronische hepatoxiciteit: 1. Lever fibrose: kan ontstaan vanuit steatose. Gezonde hepatocyten sterven af en deze worden door een ontstekingsreactie niet vervangen door nieuwe hepatocyten, maar door fibrose materiaal (voornamelijk collageen 1&3 en ECM-componenten) → sinusoïde/poriën in de bloedkanaaltjes gaan verloren door de ophoping van ECM materiaal → slechte uitwisseling tussen hepatocyten en sinusoïde bloed. → minder goede opname van stoffen. - stellaat cellen kunnen de ECM componenten produceren als immuunreactie wat de schade verergerd. → uitwisseling wordt negatief beïnvloed → meer litteken weefsel. Toxicologie 18  2. Lever kanker/hepatocellulaire carcinoma: ontstaat door de aanwezigheid van reactieve metabolieten voor een langere perioden. Oorzaak: Metabolieten kunnen binden aan het DNA → mutaties → leverkanker. - voedsel en milieu componenten kunnen reactieve metabolieten vormen, zoals aflatoxine B1. Idiosyncratische toxiciteit Idiosyncratische toxiciteit (iDILI)= toxiciteit die soms optreedt bij een individu, met bepaalde eigenschappen en andere omstandigheden dat leidt tot leverschade, maar niet gerelateerd is aan de dosis die je binnen krijgt, de mate van blootstelling en is niet afhankelijk van de ziekte. Verschillende mechanismes kunnen leiden tot idiosyncratische toxiciteit. De activatie van een geneesmiddel leidt tot de binding aan eiwitten en DNA → leidt tot activatie van verschillende stress responses. Afhankelijk van de stress leidt het tot een bepaalde mate van schade in de hepatocyten dat verschilt per individue. —> kan afhangen van immuunreacties, die mogelijk de schade kunnen verergeren. Factoren die idiosyncrasie bepalen: 1. Genetica Geslacht Cytochroom, enzymen, transport systemen HLA type (immuun systeem gerelateerd) 2. Verworven in het leven Leeftijd, activiteit, reizen Infectie, slechte immuniteit, andere chronische ziektes Dieet, obesitas, supplementen Toxicologie 19  Andere geneesmiddelen, chemische blootstelling —> Er moet ook iets specifieks zijn aan de chemische structuur van een geneesmiddel die in samenspraak met de genetische factoren en de omgevingsfactoren bepalen of er een idiosyncratische toxiciteit gaat optreden. Intrinsieke toxiciteit VS idiosyncratische toxiciteit: Intrinsiek: Voorspelbaar Dosis gerelateerd Ongeveer hetzelfde in proefdieren Komt vaak voor Korte interval Types: - Directe destructie - Indirect, metabolisch - Choleastatisch Idiosyncratisch: Onvoorspelbaar Niet dosis gerelateerd Niet zichtbaar in proefdieren Komt niet vaak voor Lange interval Types: - Hypersensitiviteit - Metabolisch → sommige geneesmiddelen vallen in beide groepen. Idiosyncratische geneesmiddel toxicteit: Komt voor ondanks goeie preklinische testen. → probleem is dat je het bij idiosyncratisch pas ziet als het op een grootte populatie is getest. Toxicologie 20  Er is dus een verbetering nodig in een beter mechanistisch inzicht, in vitro methodes en translational biomarkers. → Een beter inzicht van de mechanismes zorgt voor betere voorspellingen voor lever toxiciteit en nieuwe technologie zorgt voor een toename in de kwaliteit en progressie van onderzoek. College 4: cardiotoxicity Cardiomyocyte= hartspiercellen, leveren het grootste werk. Hartspiercellen staan met elkaar in verbinding → belangrijk zodat ze samen kunnen trekken en zodat er gecommuniceerd kan worden (signalen doorgeven). Intercallated discs= overgangen tussen verschillende hartspiercellen, verbinden de hartspiercellen. Hier bevinden zich gap junctions (cel overdracht, elektrische verbinding; potentiaal verschillen kunnen worden doorgegeven) en desmosome (mechanische hechting, zodat de cellen bij contracties bij elkaar blijven) voor de communicatie. Connexonen= bestaan gap junctions uit, kleine kanaaltjes waardoor ionen en moleculen snel tussen hartspiercellen kunnen worden uitgewisseld. Sarcomere= de kleinste contractiele unit, maakt het mogelijk om samen te trekken. Bestaat uit verschillende filamenten: Z-disk= structuren waarin verschillende eiwitten samen komen, zoals alfa- actin. Actine filament= beweegt zich vanaf de Z-disk naar het midden van het sarcomeer. Thick filament= myosin → door de opbouw van het myosin kan er een connectie worden gemaakt Toxicologie 21  met het actin, conformatie verandering door calcium influx (bindt aan trolamine). Deze activatie zorgt ervoor dat er een verkorting is, doordat het actin naar het midden beweegt → samentrekken. I-band= alleen het actin filament A-band= overlap tussen myosin en actin. SERCA; zorgt dat Ca2+ weer terug komt in het SR. → myosine inactivatie. —> kost veel energie doordat het calcium wat naar binnen stroomt ook weer naar buiten moet worden gepompt. Elektrische impulsen van het hart: P-wave= depolarisatie van de atria (boezem) QRS-complex= depolarisatie van de ventricles (kamers) T-wave= repolarisatie van de ventricles QT-interval= een cycle van depolarisatie en repolarisatie. geeft de actiepotentiaal duur aan. Hierdoor fungeert het als een maat om te bepalen of het hart goed klopt. Wanneer het QT-interval langer wordt is dit een maat voor het niet meer goed functioneren van het hart. Toxicologie 22  Mitochondriën= zorgen voor het energie in de hart, in de vorm van ATP. Metabolisme: wanneer door hartfalen of fase in ontwikkeling de hartspiercellen niet goed functioneren zal de ATP-productie van vetzuren een shift maken naar glucosemetabolisme. Het zorgt ervoor dat de glycolytic pathway wordt geactiveerd, dit is een anaerobe pathway. Dit gebeurt voornamelijk wanneer het hart niet goed doorbloed wordt (bloedvaatjes vernauwd of bloedpropjes bijv.) —> Bij hartfalen/fase in ontwikkeling is dus een shift van aerobe naar anaerobe metabolisme bij de hartspiercellen. Wanneer de calcium regulering verstoort is kunnen er allerlei andere mechanismes geactiveerd worden, zoals de activatie van de calcineurin pathway. → splits fosfaatgroepen af van NFAT (dephosphorylates) → komt in de kern → kan genen activeren van hypertrophic (zorgt voor een sterkere contractie) → het hart wordt groter. —> dit kan genetisch ontstaan, maar ook door een toxisch effect. Op langer termijn is dit nadelig voor het hart, hypertrophic moet gereduceerd worden. Toxicologie 23  Hypertrophic is belangrijk voor de ontwikkeling van het hart. Pathologische hypertrophic is na bv. een hartinfarct, het verlies aan hartspiercellen. → door het verlies worden de andere hartspiercellen groter, hypertrophic. Ze gaan niet meer delen door de lage proliferatie capaciteit van de hartspiercellen. De hele biochemische huishouding van hartspiercel veranderd wanneer er te veel calcium in de cel komt, hierdoor verliest de hartspiercel zijn specifieke functionaliteit. En daarnaast beïnvloedt het de contractie; de myocyte kunnen namelijk niet goed ontspannen. Schade aan de hartspiercel heeft effect op het gehele hart. Fibroblasten= worden geactiveerd bij schade. Ze gaan profileren en extracellulaire matrix componenten produceren, wat leidt tot fibrose (opstapeling collogeen), zodat het hart stijver wordt, vermindering van de functie. Hartspiercellen hebben een lage proliferatie, de schade wordt niet herstelt → vandaar proliferatie van de fibroblasten die de schade proberen te herstellen. Degeneratie van myocyte is de ultieme reactie op toxische blootstelling. Hoge bloeddruk is schadelijk voor de hartspiercellen. Toxicologie 24  Biomarkers bij schade aan het hart: Creatine kinase= Drijf ATPase-reacties aan onder zeer veeleisende omstandigheden. Hartfalen in verband gebracht met lagere niveaus van gefosforyleerd creatine, Het is een biomarker om schade te identificeren. MB is de isovorm van het hart. Creatine kinase draagt een fosfaat over van fosforcreatine naar ATP → efficiënter dan oxidatieve fosforylering, de myocyte kunnen veel ATP aanmaken. Myoglobin= wordt ook snel vrij gegeven bij schade aan het hart. BMP —> snelle markers bij schade maar niet zeer specifiek. Cardiac troponins= specifiekere biomarker. Kunnen in lage hoeveelheden terug worden gevonden, kleine schade kan worden gedetecteerd. Het liefst wordt er gebruik gemaakt van humane modellen. Dit is niet gemakkelijk → er wordt gebruik gemaakt van pluripotente stamcellen (alle celtypes kunnen hieruit gevormd worden). De pluripotente stamcellen blijven delen. Bij het geven van speciale signalen in kweek kunnen er specifieke celtypes gevormd worden. Het probleem is dat embryonale pluripotente stamcellen ethisch zeer gevoelig zijn → hiPSC cellen. (celtypes worden omgezet naar stamcellen en vanuit daar gedifferentieerd in het celtypen dat je wilt.) Het DNA blijft wel hetzelfde, alleen het omhulsel wordt veranderd; het DNA moet intact blijven, zodat fouten in het DNA kunnen worden geïdentificeerd. Zo blijven de defecten in de patient en in het kweekschaaltje gelijk. —> er kunnen ziektes worden bestudeerd en medicijnen worden getest. Medicijnen komen niet door de test door lage effectiviteit en onverwachte cardiotoxiciteit. Toxicologie 25  Embryonale pluripotente stamcellen Na een hartinfarct heb je veel dood weefsel dat niet meer functioneert (infarct). → er kunnen hartspiercellen gemaakt worden uit hiPSC cellen en dit terug plaatsen. Ontwikkeling van het hart met de bijbehorende transcriptiefactoren. NKX2.5= transcriptiefactor belangrijk voor de hartformatie dat vroeg is geactiveerd en geactiveerd blijft. → als je veranderingen inbrengt in het DNA door bv. GFP te integreren heeft dat effect op het gen. cardiotoxiciteit kan effect hebben op de contractie en op de elektrische conductie van het hart. Verstoring in depolarisatie en repolarisatie van de ventricles kan leiden tot hartritmestoornis. → medicijnen die een effect hebben op de hartspiercellen beïnvloeden het HERG Toxicologie 26  kalium kanaal, door het bv. te blokkeren. → Verlengt QT; gebeurt door een medicijn dat de polarisatie vertraagd. → verhoogt de kans op een hartritmestoornis. MEA= 2D assay, je leest het veld potentiaal af. Ikr= belangrijk kanaal voor snelle uitwisseling van kalium. Iks= minder dominant kanaal voor de uitwisseling van kalium. Bij de blokkering van Iks met een geneesmiddel kan er nog steeds kalium worden uitgewisseld, er is een volledige repolarisatie. Als zowel de Ikr als de Iks geblokkeerd is, door een medicijn en mutatie in Ikr, kan er geen kalium naar buiten. → verlenging QT. → toxiciteit —> de patiënten die deze mutatie niet hebben kunnen wel behandeld worden met de Iks blokker → precision medicine. Acute cardiotoxiciteit= een enkele hoge dosis van een stof. → directe dood van de myocyte van het hart → Dit leidt tot plotselinge hartdood. Enkele hoge orale dosis monensin in vee kan leiden tot direct hartfalen maar pas na enkele maanden. Chronische cardiotoxiciteit= langdurige blootstelling aan lage dosis van een Toxicologie 27  stof leidt langzamerhand tot harthypertrofie. Secundair daaraan is een geleidelijk verlies van cardiale myocyte door apoptose, dit zorgt uiteindelijk voor hartfalen. —> ernstige toxische schade leidt tot cardiale celdood. Cardiotoxische geneesmiddelen: Alcohol: alcoholische cardiomyopathie (ACM) - accumulatie van acetaldehyde vanwege leverschade of te veel reactief oxidatief metabolieten uit alcohol veroorzaakt hartschade. Anti-aritmica: Deze geneesmiddelen zorgen ervoor dat het hart weer goed ritmisch kan kloppen door het blokken van Na+, Ca2+, K+ -kanalen en b- adrenerge receptor (signalering naar Ca2+ -kanalen). Cardiotoxisch door uitbreiding van hun farmacologische werking. Geneesmiddelen met CZS: Deze geneesmiddelen hebben effecten op belangrijk signalerende receptoren (GPCR), en vooral de ion kanalen van het hart. Lokale anesthetica: Deze blokkeren Na+-kanalen reversibel in neuronen (bijvoorbeeld cocaïne). Een te hoge dosis zorgt ervoor dat er een afname is in depolarisatie van het hart. Antimicrobiële/antivirale middelen: Overdosis leidt tot het blokkeren van het ionenkanaal. Cardiotoxische geneesmiddelen – ontstekingsremmende middelen: Niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAIDS): remming van cyclooxygenase (COX), die prostaglandine produceert (vasodilatatie, koorts, pijn). → Andere toxiciteit dat effect kan hebben op het hart. Niet-selectieve NSAIDS, b.v. aspirine blok COX-1 & -2 veroorzaken maagproblemen. COX-2 verhoogd effect voor een hartaanval. Nieuwe generatie blokkeert alleen COX-2, hierdoor zij er geen maagproblemen meer. Antikanker geneesmiddelen kunnen resulteren in cardiotoxiciteit. → verdere onderzoeken nodig naar betere medicijnen of een combinatie die zorgt voor een remming van de cardiotoxiciteit. Diermodellen zijn niet helemaal juist, wordt gebruik gemaakt van stamcellen. Doxorubicin, een antikanker geneesmiddel, grijpt in op verschillende mechanisme → reden van cardiotoxiciteit is onduidelijk. De toxiciteit is dosis afhankelijk. Het verlaagd de contractiekracht op een dosisafhankelijke manier in 24 uur. Toxicologie 28  3D modellen: wordt niet meer alleen gekeken naar de morfologie, maar ook naar de elektriciteit, contractiekracht en hoeveel er wordt gepompt (relaxatie). → zie presentatie voor uitleg van de modellen, zoals EHT’s. College 5: Biochemical mechanisms of toxicity and cell death Mechanismes of toxicity and adverse outcome pathways Cell fate= uitkomst van de gebeurtenissen binnenin de cel. Gebeurtenissen leiden tot het doodgaan van de cel. Adaptieve stress response= response om proberen te overleven. Molecular initiation events= het aangrijpingspunt waar het geneesmiddel aan bindt, initiële interactie van het molecuul met het biologische systeem Key events= gebeurtenissen die van essentieel belang zijn om te leiden tot toxiciteit. Mode of action= alle gebeurtenissen achter elkaar, werkingsmechanisme. Point of departure= dosis waarbij een bepaalde gebeurtenis gaat plaatsvinden. Toxicologie 29  Adverse outcome/bijwerkingen= het pathologisch event wat de toxiciteit bepaald. Intrinsic toxicant/intrinsieke giftige stof: er wordt een reactief metaboliet gevormd dat kan binden aan eiwitten. Specifieke eiwitten zijn belangrijk voor de ontwikkeling van toxiciteit → een fractie van eiwitten leidt tot toxiciteit. moleculen met een laag moleculaire gewicht: - lipiden in het membraan → gaan kapot → toxiciteit - glutathione moleculen met een hoog moleculaire gewicht: - eiwitten - DNA —> lage eiwitbinding kan geen kwaad → niet schadelijk —> binding aan DNA → mutaties → kan schadelijk zijn Interactie van chemische stof met cellulaire doelwitten → Moleculaire initiatiegebeurtenissen. Factoren die van belang zijn of er toxiciteit ontstaat: 1. Bereikbaarheid van het target. 2. Wat voor soort binding het is; covalent, non-covalent (als de concentratie afneemt verdwijnt de interactie) 3. De consequenties van het binden van de target. Toxicologie 30  Cell maintenance= het behouden van de normale homeostase binnen in de cel → het is van belang dat de eiwit en ATP synthese kan plaatsvinden. Tevens belangrijk voor de homeostase van het gehele systeem. Cell regulation= het functioneren van de cel. → veranderingen in de genexpressie kunnen leiden tot tumoren. —> Er zijn verschillende biologische gevolgen van giftige stoffen op doelorganen. Molecular and biochemical mechanisms underlying cell necrosi Sublethal injury= de schade waarbij een cel het zelf nog kan herstellen. Als de schade te groot is zetten de cellen apoptose in, geprogrammeerde celdood dat onomkeerbaar is. Necrosis= niet geprogrammeerde celdood, onomkeerbaar. Toxicologie 31  Verschillen necrose en apoptose: 1. Bij apoptose ontstaan er apoptotische lichamen, kleine blaasjes met cel inhoud en bij necrose valt het membraan uit elkaar en valt alle inhoud van de cel naar buiten → meer immuunreacties, dus necrose leidt tot meer schade. 2. Apoptose is een actief proces en necrose is een passief proces. 3. Immuun cellen versterken de schade bij necrose. Je krijgt geen sterke ontstekingsreactie bij apoptose 4. Apoptose is een evolutionair geconserveerd pad en necrose toxische stof- specifiek biochemisch mechanisme. Triggers van apoptose en necrose: Apoptose 1. Remmers van kinasen 2. Tumornecrosefactor 3. Calciumionoforen 4. Ioniserende straling 5. Chemotherapeutica Toxicologie 32  6. Chemische giftige stoffen 7. Intrekking van groeifactoren 8. Verlies van celadhesie Necrose 1. Remmers van mitochondriën 2. Pro-oxidanten 3. Calciumionoforen Biochemische verschillen tussen apoptose en necrose: Apoptose 1. ATP-uitputting: 25-50% 2. Ca2 + toename 200-400 nM 3. Matige productie van ROI 4. Progressief verlies van GSH 5. Vereist caspases → het aanzetten van de ontwikkeling van celdood Necrose 1. ATP-uitputting: 70-100% 2. Ca2 + toename> 1 uM → Bij te veel calcium gaat de cel dood 3. Hoge ROI 4. Snelle, uitgebreide thiol oxidatie 5. Vereist geen caspases Voorkomen van necrose bij pathologische aandoeningen: Ischemie condities: te kort aan zuurstof in zuurstof gewilde weefsels (longen etc.), leidt tot een te kort aan ATP Ischemia-reperfucie: periode nadat ischemie veroorzaakt → verergerd de situatie, want door het stijgen van het zuurstof gehalte is er een hoge mate ROS-vorming Blootstelling aan toxische stoffen: bijv. Overdosis paracetamol → hoge niveaus van reactieve metabolieten die mitochondriën beschadigen en GSH afbreken. Biochemische pathways in necrose: Toxicologie 33  1. ATP depletion/uitputting: Mitochondriën: oxidatieve fosforylering is kritisch voor ATP-productie Geneesmiddelen kunnen mitochondriën toxiciteit veroorzaken, waardoor minder ATP wordt geproduceerd. Voorbeeld: Valproïnezuur en mitochondriale toxiciteit. Gebruikt in epilepsie, wordt beschreven via cyto p450 → co-enzym A vangt ie weg → co-enzym A daalt → minder vetzuur oxidatief → Lagere productie van ATP. De ademhalingsketen bestaat uit verschillende complexen. Er zijn verschillende toxische stoffen die specifiek kunnen ingrijpen op deze complexen. 2. Calcium verstoring: Concentratie is de cel is lager dan in het bloed. → calcium dat de cel instroomt moet worden opgevangen in intracellulaire ruimtes of naar buiten worden gepompt. Opslag calcium ER → activatie receptoren leidt tot het loslaten van het calcium binnen in de cel en keert terug na de korte activatie van de enzymen. —> te hoog calcium niveau leidt tot het lang activeren van enzymen. Kan Toxicologie 34  komen doordat pompen geremd worden of het niet meer doen, door het naar beneden gaan van het ATP. Consequenties: kan bijdragen tot de vorming van vrije radicalen → schade aan eiwitten. Hoog calcium zorgt ervoor dat enzymen actief zijn die dat normaal niet zijn → toxiciteit 3. Oxidatieve stress: elektronen die door de ademhalingsketen stromen kunnen ontsnappen, voordat ze de hele keten hebben doorlopen en reageren met zuurstof → zuurstof vormt een radicaal; reactief zuurstof, ROS, zeer toxisch. Kan schade brengen aan lipiden en ionen. Onschadelijk maken door gebruik te maken van enzymen die dit kunnen detoxificeren tot waterstofperoxide (H2O2), maar ijzer kan dit weer omzetten naar een HO radicaal. → beschadigd DNA —> waterstofperoxide moet ook worden opgeruimd; het wordt omgezet in water met twee gluthation moleculen → wordt omgezet in geoxideerd gluthation → gluthation reductase nodig om dit weer om te zetten naar gluthation, met het gebruik van ATP. HO radicalen kunnen lipidenradicalen vormen door te reageren met water: Toxicologie 35  Molecular and biochemical mechanisms underlying cell apoptosis Apoptose/celdood is een belangrijk biologisch proces. Bij het niet doodgaan van de neuronen bij de embryonale ontwikkeling kan het leiden tot uitstulpingen van de hersenen. Alle cellen hebben een overlevingsfactoren → je wilt bv. geen levercel in een ander deel van het organisme → apoptose. Ongewilde apoptose: Bij acute schade aan het weefsel: aan de randen van de schade heb je apoptose (deze cellen herkennen de schade nog), terwijl aan de binnenzijde necrose. Chronische weefselschade: als er ontstekingsreacties plaatsvinden, waardoor immuun cellen gezonde cellen beschadigen → gaan dood door apoptose. Auto-immuun ziekte: de immuun cellen weten niet meer welke cellen wat zijn en maken cellen ongewild dood, met gebruik van apoptose. Defecten in celdood bij: - kanker → genen die hierbij betrokken zijn, zijn gedereguleerd door mutaties. - T-cell selectie; auto-immuunziekte. → bij een defect in celdood blijven de cellen leven terwijl ze dood hadden moeten gaan. Apoptose 3 fases: 1. Inductie fase: remming van kinase, bestraling, wegnemen van groeifactoren. Het is afhankelijk van de type stressor die de cel ontvangt. Toxicologie 36  2. Effector fase: het gevolg van de inductie. Er is een balans tussen de gene die de cellen willen laten leven en dood willen laten gaan. —> Balans switch naar de genen die actief zijn voor celdood → point of no return → degradatie fase 3. Degradatie fase: Belangrijke enzymen: a. protease= breken eiwitten af. b. nucleases= breken DNA materiaal af, activering van endonuclease; de nuclease knippen het DNA tussen nucleosome. Cel verandert morfologisch Caspases: protease familie die een rol spelen in het proces van geprogrammeerde celdood en ontstekingsreacties. Caspases zijn proteasen die van belang zijn voor het afbreken van het eiwit. - Grote familie van sterk geconserveerde cysteïne afhankelijke aspartaat- specifieke proteasen. → ze knippen achter een aspartaat residue met een specifieke sequentie. - Gebruik cysteïne als katalytisch nucleofiel en splits substraten na een asparaginezuurresidu - caspases zijn zymogenen; ze bestaan als inactieve pro-vormen in de cellen en worden geactiveerd na proteolytische splitsing. Toxicologie 37  het regelmechanisme voor celdood in C.elegans komt overeen met een zoogdier. De caspase familie wordt ingedeeld op de functie, functies: cytokine activation → regulering van de activiteit van het immuunsysteem Apoptose effector → heeft een kortere structuur dan de initiator. Apoptose initiator → hebben domeinen die van belang zijn. De domeinen missen in de effector. Mechanisme van de activatie van caspase: Het procaspase bestaat uit een inactief caspase subunit en prodomein dat door de cel heen zweeft. Bij apoptose wordt het pro-enzym in stukken geknipt → tetrameer wordt gevormd, bestaand uit p10 en p20 → het actieve caspase. Toxicologie 38  In normale cellen bevindt zich het prodomain alleen inactief → anders gaan alle cellen in apoptose. 2 type apoptose caspases: 1. initiator caspase; apicale, hebben een groot prodomein. Activeren de effectorcaspasen → splitsen inactieve pro-vormen van effectorcaspasen, waardoor ze worden geactiveerd. 2. effector caspase; beul, hebben een klein prodomein. Knippen eiwitsubstraten in de cel, wat leidt tot apoptose. —> Beide moeten actief zijn om een apoptotische cel te vormen. Wordt dus gereguleerd door de activering van de initiator caspase. —> Het knippen van DNA en het veranderen van de cellulaire structuren vindt alleen plaats als de effector caspases actief zijn geworden. Twee routes van caspase-3 activatie/twee routes om een cel dood te maken: 1. Extrinsiek: → Doodreceptor-gemedieerde activering; Signalen van buiten af, het is afkomstig van het immuunsysteem. a. TNF-receptorfamilieleden inclusief FAS- en TRAIL-receptor worden geactiveerd door hun liganden, death liganden genoemd (FADD). → receptoren komen bij elkaar en zorgen ervoor dat een eiwit intracellulair kan binden → Actief caspase 8/10 kan het procaspase 3 in stukken knippen → actief caspase-3. Toxicologie 39  2. Intrinsieke: Binnen in de cel wat zelf plaats vindt, het herkent de schade. De mitochondriën laten cytochrome C los en komt in het cytosol → bindt aan Apaf eiwit → het eiwit ontvouwt → CARD domein komt vrij en bindt aan procaspase-9 → vorming apoptosome → actief maken van procaspase 9 met apoptosome → knipt procaspase 3 → actief caspase 3. In sommige cellen is er een koppeling tussen de death receptor en de intrinsieke pathway. Werking; Bid wordt geknipt door caspase-8 → zorgt ervoor dat cytochrome C vrij komt uit de mitochondriën. —> is efficiënter want kan sneller meer actief caspase-3 gevormd worden Caspase-3 knipt veel verschillende eiwitten → er ontstaan fragmenten van eiwitten die niet meer functioneel zijn of actief, wat resulteert tot apoptose. Alle eiwit fragmenten spelen een verschillende rol tot apoptose. De activering van proteases moet goed gecontroleerd worden. Dat beslismoment vindt plaats in de effector fase waarbij er een balans is tussen eiwitten die Toxicologie 40  proberen de cel dood te maken en eiwitten die de cel probeert te beschermen. De regulering vindt plaats op het niveau van de mitochondriën. Het membraan wordt permeabel gemaakt, door verstoringen zoals redox catastrophy en bioenergetic catastrophy, zodat het cytochrome C eruit kan. → caspase activatie → apoptose Bcl2 blokkeert apoptose en beschermt de mitochondriën tegen de release van cytochrome C, het is anti-apoptosis. Bax en Bak kunnen een porie vormen waardoor cytochrome C kan lekken → Bax en Bak zijn pro-apoptotische Bcl2 wordt geremd bij apoptose door binding, zodat het inactief is en niet meer beschermt → apoptose. BH3 is een antagonist van Bcl2 In kanker heb je een verhoging van de pro-survival familie, zoals Bcl2, A1 (afhankelijk van het type tumor). → Mogelijk mutaties bij kanker waardoor in de eiwitten, waardoor apoptose niet in gang kan worden gezet. Toxicologie 41  DNA schade kan leiden tot de activatie van p53 → BAX, NOXA, BAD, Puma worden aangezet → stimuleert apoptose Afhankelijk van de type en mate van de schade duurt het een bepaalde tijd tot apoptose. Als eenmaal besloten is om dood te gaan is het een heel actief en snel proces. College 6: Cellular stress responses: from adaptation to adversit Alle organellen kunnen worden blootgesteld aan stress. Specifieke stress response pathways kunnen de stress wegnemen in de organellen en de homeostase bereiken. Te hoge stress leidt onomkeerbare schade → apoptose of necrose. De concentratie, dosis en soort stress bepaald of het adaptief is of leidt tot toxiciteit/adversiteit. Een stof dat aangrijpt op meerdere stress pathways leidt tot adversiteit bij een lagere concentratie. Toxicologie 42  Met de LD50 kan de concentratie worden bepaald waar de grens ligt van adaptie en adversiteit. Klassieke routes betrokken bij toxiciteit:  Mitochondriale schade  Oxidatieve stress  DNA-schade  Eiwitschade  ER-stress  Ontsteking  AhR-receptoractivering Concepten van cellulaire signaleringen: Signal transduction - post translational modifications; een eiwit kan gemodificeerd worden door de toevoeging van een klein molecuul. Modificaties kunnen functie, activiteit of bestemming beïnvloeden. Fosforylering= er wordt een fosfaat groep toegevoegd door gebruik te maken van kinases, leidt tot een verandering van de activiteit. Kost ATP. Fosfatase kunnen de fosfaatgroep verwijderen. Toxicologie 43  Pathway: MAP-kinase signaaltransductiecascades Ubiquitinatie= Een polypeptide keten van 8 kDa. Kan covalent gebonden worden aan een eiwit, door gebruik te maken van E1, E2 en E3 enzymen. Hoe een ubiquitin gebonden wordt bepaald de uitkomst. De-ubiquitin kan de groep verwijderen. → de vormig van een ketting rechtop leidt tot een signaal voor een proteosome om het af te breken. Pathway met p53 → post-translationele modificaties (PTM); signaleringsroute bij DNA-schade Voorbeelden van stress pathways: 1. Heat shock response; eiwitten in het cytoplasma zijn niet meer functioneel; gevoelig voor de vorming van aggregaten en afbraak. Toxicologie 44  Chaperonnes laten los van heat shock → binden aan eiwitten die niet of verkeerd gevouwen zijn om het opnieuw te laten vouwen. —> meer chaperonnes zodat de cel beter kan omgaan met ongevouwen eiwit. Verschillende factoren leiden tot HSR: 1. omgevingstress 2. pathofysiologische staat 3. niet stressvolle situaties 2. Unfolded protein response in ER; opstapeling van verkeerd gevouwen eiwitten in het ER. Verbindingen die een UPR veroorzaken: a. Brefeldin A (verstoort Golgi-apparaat) b. Tunicamycine (remt eiwitglycosylering) c. Thapsigargin (beïnvloedt Ca2 + opslag in ER) d. Reductiemiddelen (beïnvloedt de eiwitvouwing direct op proteïne S-S- bruggen) De UPR-reactie: 1. Vermindering van de eiwitbelasting die het ER binnenkomt Toxicologie 45  2. Toename van de capaciteit van de ER om ongevouwen eiwitten te behandelen 3. Dood Drie verschillende receptoren voor de ongevouwen eiwitten in het ER: Bij stress laat het chaperon Bip los en activeert het deze drie receptoren. specifiek UPR in de lever, omdat het veel blootgesteld wordt aan schadelijke stoffen. 3. Inflammatie; NF-kB-signaleringsroute; geen stress → gekoppeld aan ikB → niet actief en translocatie naar de kern is niet mogelijk. Bij stress wordt ikB gefosforyleerd en geubiquitineerd → translocatie naar de celkern → kan targetgenen induceren → de reeks targetgenen worden gemoduleerd, zoals anti-apoptotische eiwitten NF-kB is een dimeer en er zijn meerdere soorten NF-kB. → Alle verschillende familiemembers kunnen verschillende dimeren met elkaar vormen en daardoor een andere manier van modulering van de biologie hebben, ze zetten andere target genen aan. Toxicologie 46  4. Oxidatieve stress response; Het systeem wordt gecontroleerd door kaap1, betrokken bij de ubiquitinering van de transcriptiefactor Nrf2. Nrf2 wordt weer afgebroken → inactief. Door oxidatieve stress wordt kaap1 gemoduleerd. In kaap1 zitten veel thiolgroepen die worden beïnvloed door deoxidatieve stress. Kaap1 gaat zich anders vouwen en dit leidt ertoe dat Nrf2 niet meer geubiquitineerd kan worden. Cellulaire stress reacties kunnen bekeken worden door gebruik te maken van een fluorescentie molecuul en deze te koppelen aan een biomarker. → hiermee kan gekarakteriseerd worden welk stress response optreedt bij een specifieke concentratie van het geneesmiddel. Hoe feller de groene kleur, hoe actiever de biomarker. College 7: DNA damage response and carcinogenicity Kanker is een genetische ziekte. → mutaties in genen zorgen ervoor dat de tumoren ongecontroleerd gaan groeien. Toxicologie 47  Verschillende categorieën carcinogenen stoffen: 1. Direct genotoxisch → beschadigen direct het DNA (één mutatie is al genoeg voor het ontstaan van kanker) a. Als je blootgesteld blijft krijg je meerdere mutaties. → mutaties werken samen om een tumor te vormen. i. Genomische instabiliteit speelt een rol bij het ontstaan van spontane mutaties. b. Het kunnen stoffen uit de omgeving zijn, uit je lichaam of medicijnen. 2. Indirect genotoxisch → kunnen andere stoffen veranderen, waardoor het DNA beschadigd raakt. 3. Niet genotoxisch → het beschadigen van het DNA is geen primaire activiteit. a. De mutatie is al aanwezig. b. Asbestos is een niet genotoxische carcinogenen stof. De fibers in de cel leidde tot een ontstekingsreacties → bijdrage aan de vorming van kanker, het is een indirect mechanisme. Bij de indirecte en niet genotoxische stoffen heb je te maken met een drempelwaarde waarbij de stof schadelijk is → direct genotoxisch heeft geen drempelwaarde. IARC klassificatie: Class 1: bekend dat de stof kanker veroorzaakt Class 2A: humane data is beperkt → onvoldoende bewijs dat een carcinogenen stof is. —> wel vastgesteld in dieren dat het een carcinogenen stof is. Class 2B: humane data is beperkt → onvoldoende bewijs dat een carcinogenen stof is —> het bewijs bij proefdieren is niet helemaal zeker dat Toxicologie 48  het carcinogeen is. Class 3: onduidelijk of het carcinogeen is. Class 4: hoogstwaarschijnlijk is het geen carcinogenen stof. Het ontstaan van kanker bestaat uit meerdere stappen. Je moet de volgorde van het ontstaan van kanker weten Bij het muteren van het genoom zijn er veel genen die kunnen muteren zonder dat het invloed heeft. Mutaties in Proto-oncogenen en tumor suppressor genen (genen die er voor zorgen dat cellen normaal door groeien) hebben veel invloed op het ontstaan van kanker. Oncogenen: dominant (gain off function) → gemuteerd is het dominant actief. Cellulaire proto-oncogenen die gemuteerd zijn en geactiveerd. cellulaire proto-oncogenen die gevangen zijn door retrovirussen en daarbij gemuteerd zijn en geactiveerd. virus specifieke genen die zich gedragen als cellulaire proto-oncogenen die gemuteerd zijn tot oncogenen. Tumor suppressor genen: recessief (loss off function) → er zijn twee kopieën (van vader en moeder). Bij de aanwezigheid van één kopie is dat genoeg om tumorvorming te Toxicologie 49  onderdrukken. verlies van cellulair gen of chromosoomgebied door deletie verlies van gen functie door een inactiverend puntmutatie verlies van gen functie door epigenetische silencing (bijv. methylering) Consequentie van proto-oncogene mutatie → receptor wordt geactiveerd zonder de aanwezigheid van het ligand → veroorzaakt kanker Oncogenen en tumor suppressor mutaties hebben effect op de cel biologie. → veel targets (receptoren) die kanker kunnen veroorzaken als ze gehyperactiveerd worden. Driver mutaties= leveren een bijdrage aan de celgroei. Verschillend aantal driver mutaties voor verschillende soorten kanker. Het verschil in driver mutaties verschilt ook per kind en volwassenen. De cellen in de tumoren hebben niet allemaal dezelfde mutaties. (startmutaties komen vaak wel overheen) → Heterogeniteit → lastig te behandelen. Toxicologie 50  De relatie tussen de exposure en het ontstaan van tumoren Hogere dosis → meer kans op kanker Rood genotoxische stof. Blauw niet genotoxische stof De drempelwaarde bij de niet genotoxische stof is zichtbaar in de grafiek. Er is een upper-limet. Hallmarks van kanker: wordt kanker aan gekenmerkt Sommige chemische stoffen hebben geen metabolisme nodig om DNA te kunnen beschadigen. —> bij chemische stoffen die metabolisme nodig hebben moet je een test systeem hebben waar dit metabolisme in kan optreden. Ames testen= assay met bacteriën om te kijken welke chemische stoffen DNA beschadigen. → DNA schade door de chemische stof kan er voor zorgen dat de bacterie groeit zonder de aanwezigheid van histidine. —> je gebruikt ratten levers zodat het metabolisme kan plaatsvinden. Toxicologie 51  —> sommige stoffen bekijken in eukaryoten cellen. → Er is schade door replicatie problemen die specifiek zijn voor eukaryoten cellen → dierproeven. → meer humaan relevant. DNA is niet geheel stabiel → het balans tussen het repareren en het laten ontstaan van mutaties heeft evolutionaire voordelen. —> genetische variatie is voor een mens van belang zodat het zich kan aanpassen aan de omgeving → een maat van instabiliteit van het DNA moet worden toegestaan. Het schade-herstel mechanisme is in staat om vormen DNA schade te herstellen. Mechanismes voor het herstellen van DNA schade: Silent mutatie= heeft geen effect op het eiwit nonsense= mutatie waardoor er opeens een stopcodon komt eerder dan normaal → heeft consequenties voor de functie van het eiwit. missense= mutatie waardoor een aminozuur wordt veranderd in een ander aminozuur → in p53 kan dit resulteren in een negatief dominant variant. → door insertie of deletie klopt de code niet meer → andere aminozuren —> frame shift mutaties zijn erger, omdat een groot deel van het eiwit niet functioneel is. Toxicologie 52  P53= master regulator van de DNA schade respons. Het is een transcriptie factor. Het verlies van de functie van p53 kan een cel met schade door groeien. P53 mutaties speelt een rol in alle soorten kanker. Sensors= herkennen het beschadigde DNA Mediatoren= worden geactiveerd door sensors, recruiten substraten, zijn de basis voor signalerings complexen Effectoren= substraten voor sensors die signaleren voor herstel, cell cyclus of survival. ATM signalering speelt een belangrijke rol bij de response op dubbel strand break. Belangrijke mechansime: non-homologous end joining, homologe recombinatie, Theta-mediated end joining. —> cellen zonder ATM zijn heel gevoelig voor ioniserende straling geinduceerde double strand break Toxicologie 53  → ATM kan lokaal en globaal zijn. ATR signalering speelt een rol bij replicatie geassocieerde schade. Het is essentieel voor replicerende cellen (ATM niet). Wordt geactiveerd door verschillende schade aan het DNA. → kunnen downstream op een vergelijkbare manier de schade laten repareren of in apoptose laten gaan etc. → ATR kan lokaal of globaal zijn. DNA-schade heeft een effect op de signalering naar alle drie de ATM/ATR- effectoren. (DNA repair, apoptose, cell cycle arrest) Kleine maat van schade wordt herstelt → geen kanker en geen veroudering. Veel schade → cel in apoptose, necrose → snellere veroudering. College 8: Cancer immunotherapy and toxicity Immuun systeem heeft 2 takken: 1. adaptief → dit deel van het immuun systeem kan leren Toxicologie 54  B cellen (antilichamen → in hele lichaam antigenen stabiliseren) T cellen/ lymfocyten (cellulaire imuun respons; kunnen indringers in andere cellen herkennen en uitschakelen) 2. aangeboren → dit imuun systeem leert niet van de ervaringen antigeen presenterende cellen (dendritische cellen en macrofagen) Cytotoxische cellen (NK (natural killer) cellen, macrofagen → doden andere cellen) eiwitten (complement) T cellen: Brengen T-cel receptoren tot expressie → dit kan antigenen herkennen Iedere T-cel heeft een specifieke T-cel receptor → een populatie van T-cellen kunnen heel veel indringers herkennen. —> bij herkenning van de receptor → t-cellen delen → vormen een leger → andere cellen doden; cytotoxisch Cytotoxic granules= bevindt zich binnen in de T-cellen in blaasjes. Perforine wordt uitgescheiden in de ruimte tussen de T-cel en target → gaatjes in de target cel → Granzymes kunnen de target cel binnen dringen → knippen procaspases → apoptose pathway wordt in gang gezet. T-cellen moeten eerst geactiveerd worden → veiligheidsmechanisme. Worden geactiveerd door: Anti-gen presenterende cellen (dendriet); zitten in alle weefsels. Toxicologie 55  Costimulatie: verschillende moleculaire interacties spelen een rol. Moleculen komen tot expressie in antigen presenterende cel en T-cel → er vinden veel interacties plaats tussen verschillende moleculen. —> signalen kunnen ook inhiberen, zoals CTLA4 en PD1. → zorgt ervoor dat de T-cellen niet te veel geactiveerd worden, anders richten ze te veel schade aan aan je weefsel. CTLA4= molecuul dat tot expressie komt in de T-cellen. T-cellen die nog geen antigen hebben gezien hebben al wel CTLA4 tot expressie, alleen is het eiwit aanwezig in intracellulaire blaasjes → er kan nog geen interactie plaatsvinden. —> Bij stimulatie van de T-cel gaat het CTLA4 naar het oppervlakte. → interactie met CD80/86 —> CD80/86 geeft een positief signaal met CD28, maar een negatief signaal met CTLA4 → gaan met elkaar concurreren, waarbij CTLA4 wint. PD1 - PDL1/2 interactie vindt plaats in de weefsels die ontstoken zijn, waar T-cellen hun activiteit verrichten. IFN-gamma= cytokine geproduceerd door T-cellen in bv. een tumor. Zorgen ervoor dat de cellen daarop reageren → brengen PDL1/2 tot expressie → geeft een negatief signaal aan PD1 dat zich bevindt op de T-cel → T-cel worden uitgeschakeld door de interactie: T-cel exhaustion. → zo ontwijken tumorcellen het immuun systeem T-cellen migreren continue door het lichaam via het bloed. Anti-gen presenterende machine: proteasome knipt grote eiwitten in oligopeptides → oligopeptides getransporteerd naar ER door tapasin (TAP)→ Toxicologie 56  oligopeptides binden aan MHC (HLA in de mens) → gaat naar celoppervlak → T cel kan dit dan herkennen. T-cel herkent de peptide door de MHC. Een leeg MHC molecuul of met een peptide molecuul dat de T-cel niet kent reageert het niet. Verschillende MHC moleculen, omdat verschillende type t-cellen kunnen reageren op de verschillende type MHC. T-helper/CD4+= beslissen wat voor soort response er moet komen. Communiceren met MHCII → B-cell response. —> CD8+ communiceert met MHCI → cellen moeten worden vernietigd Het systeem reageert niet op lichaamseigen eiwitten, omdat de T-cellen die reageren op eigen eiwitten worden vernietigd gemaakt in de tymus —> Immune tolerance → T-cellen die niet zullen reageren worden ook afgemaakt. —> dit gehele proces noem je centrale tolerantie Werkt niet perfect → perifere tolerantie; regulatory T-cel onderstaat → onderdrukken lokale immuun responsen Bij de immunosurveillance bij kanker spelen T-cellen een belangrijke rol. Toxicologie 57  TIL= tumor infiltrerende lymfocyten Hoe reageren T-cellen op kanker (kankercellen zijn niet lichaamsvreemd, zijn onze eigen cellen): Door mutaties veranderen eiwitten → presentatie van cellen kan iets veranderen dan waar de T-cellen op getraind zijn —> T-cellen moeten reageren op tumor antigenen De T-cellen moeten het tolerantie mechanisme overleven. Twee soorten tumor antigenen: tumor specifieke antigenen (TSA) en tumor geassocieerde antigenen (TAA) Verschil tussen TSA en TAA: TSA (neoantigenen): Kan ontstaan door mutaties die optreden tijdens de ontwikkeling van de tumor TAA: Lichaamseigen eiwitten Kan ontstaan uit genen die normaal alleen tot expressie komen tijdens embryogenese (oncofetale antigenen) of in kiemcellen (kanker-testis antigenen) nu tot expressie komen in kankercellen. Kan ontstaan door genen die alleen in bepaalde weefsels tot expressie komen (differentiatieantigenen zoals tyrosinase) —> De expressie van deze genen wordt heel hoog, waardoor T-cellen op de lichaamseigen eiwitten reageren. Ondanks het immuun systeem ontstaan er tumoren door bv. MHC te down reguleren → T-cel herkent niet dat er iets mis is. —> tumoren kunnen op verschillende manieren het immuun systeem ontwijken. Immuun therapie gebaseerd op T-cellen opsplitsen in twee soorten: 1. Aspecifiek immuun response: je maakt gebruik van immuun response die gaande zijn in het lichaam, je blaast ze allemaal weer tot leven. Risico: je wekt alle immuun response op (ook van virussen etc.), wat kan leiden tot toxiciteit → specifiek is veiliger. a. High dose interleukin-2: een van de eerste vormen van immuun therapie. De therapie is niet succesvol op alle patiënten. Toxicologie 58  i. Interleukin-2=een van de cytokines die een belangrijke rol speelt in het immuun systeem. Is belangrijk voor de proliferatie, differentiatie en overleving in T-cellen. 1. T-cellen produceren IL-2 zelf → ze stimuleren zichzelf met gebruik van de IL-2 receptor. a. Als alle 3 de subunits tot expressie komen krijg je een hoge response op IL-2. Kan ook reageren met 1 actieve keten, maar de expressie is lager. ii. Er treedt een specifieke vorm van toxiciteit op bij deze behandeling; VLS → de bloedvaten werden meer doorlaatbaar → leidt tot adema vorming en het vasthouden van vocht → organen kunnen gaan falen —> patiënten herstelde snel van de toxiciteit. 1. Toxisch effect treedt op door directe (kon herkent worden door endotheel cellen → endotheel cellen gaan minder op elkaar zitten → lekkage) en indirecte effecten (IL-2 wordt herkent door verschillende celtypes → gaan iets doen waardoor het effect heeft op de endotheelcellen) 2. Techniek verbetert; recombinante IL-2 vormen maken die binden aan specifieke subunits. De regulatoire T-cellen brengen vooral alfa subunit tot expressie. Door te binden aan beta en gamma kan je de nier regulatoire T-cellen te activeren. 3. Het toxisch effect wordt verminderd door het specifiek toe te dienen naar de tumor. b. Immune checkpoint inhibitors: anti-CTLA4 (ipilimumab) en anti-PD1→ proberen de remming op het immuun systeem uit te schakelen door te blokkeren met antilichamen. —> Anti-PD1 effectiever. i. Een groot deel reageert niet of kort op de therapie. Biomarkers om dit te voorspellen, zoals een hoge PD-L1 expressie. Toxicologie 59  ii. Veel toxiciteit door lokale ontstekingsreactie. De toxiciteit is niet altijd T-cel gericht. 1. PD1 minder toxisch, omdat het meer lokaal werkt. a. Colitis: ontsteking aan de dikke darm, vooral bij behandeling met CTLA-4. Een belangrijke rol is de bacterie die aanwezig is in de darm van de patiënten en de CD4 T cellen spelen daar een rol bij. b. Uveitis: ontsteking van de oog. Heel lokaal, dus kan lokaal behandeld worden met steroids. c. Vitiligo: T-cellen gaan de pigment cellen van de huid aanvallen → de behandeling van de tumor is dan vaak succesvol, het is een bij effect. d. Hypophisitis: vind plaats bij CTLA-4. De hypofyse worden aangevallen door T-cellen, doordat CTLA-4 ook tot expressie kan komen in de hypofyse. —> het is moeilijk te voorspellen welke toxiciteit optreedt. 2. Specifiek immuun response: specifiek een immuun respons tegen de tumor en niet immuun respons die al aanwezig is in het lichaam. Verschillende technieken die te maken hebben met adoptive T-cell transfer (T-cellen inbrengen in het lichaam specifiek voor de tumor) a. TIL therapy: primaire tumor verwijderen → lymfocyten isoleren en laten prolifereren —> Dit zijn waarschijnlijk T-cellen die goed werken tegen de tumor, want waren daar aanwezig en je kan kijken welke T-cellen specifiek kunnen reageren op de aanwezige tumorcellen. → gevormde leger van T-cellen wordt terug geplaatst, na bestraling of chemo om het aanwezige immuun systeem plat te leggen. Toxicologie 60  b. Meerdere varianten op TIL therapy: i. TCR: De T-cellen die je inbrengt eerst genetisch modificeren. Je brengt een extra receptor in → je kan ze specifiek laten reageren op een antigen. Voordeel: je kan het zelf bepalen en je kan donor T- cellen gebruiken. 1. Het kan leiden tot on-target toxiciteit: het antigen kan ook tot expressie komen in andere weefsels. Bij donor T-cellen de MHC/HLA niet overeen komen, kunnen een response geven tegen weefsels die je niet wilt → mismatch. Het inbrengen van een TCR bij T-cellen met al een TCR kan het ervoor zorgen dat er andere dimeren worden gevormd. → moeilijk te voorspellen waar die op reageren. ii. CAR: je brengt een CAR in. Een CAR is een gen wat lijkt op een TCR, het is een mix van een antilichaam en TCR signaaldomein. i. Een voordeel is dat je niet een restrictie hebt zoals bij TCR. (een TCR kan alleen peptide en MHC stukken herkennen.) Toxicologie 61  ii. Succesvol in bloedkankers, omdat daar het antigen wat herkent moet worden heel duidelijk is. iii. In solid tumors minder succesvol, omdat het telkens aan het muteren is, de micro-omgeving is moeilijk voor T-cellen en het antigen wat herkent moet worden is niet heel duidelijk. iv. Toxiciteit: i. al je B-cellen kunnen dood gaan (B-cell aplasia) → je kan makkelijker sterven door een infectie. ii. Ook kan er een cytokine storm ontstaan. De CAR T-cellen gaan cytokines produceren → komen in het bloed → leidt tot koorts en lage bloeddruk. —> cytokine storm is afhankelijk welke CAR T-cellen het bevat. Marcofagen spelen hierbij een belangrijke rol. → gerichte behandeling tegen deze toxiciteit. —> IL-6 receptor blokker antilichaam, tocilizumab, is succesvol voor het tegen gaan van de cytokine storm. Heeft geen effect op de CAR activiteit iii. Er kan neurotoxiciteit ontstaan (ICANS) → patiënten krijgen hoofdpijn, bloedingen en lager bewustzijn. Belangrijke oorzaak hiervan is dat de bloedhersen barriere beschadigd raakt. Zowel de cytokines en als CAR T-cellen komen in het brein → activeren lokale immuun cellen. → produceren eigen cytokines. Toxicologie 62  —> cytokine storm gaat vaak vooraf ICANS. 💡 College 9: Pharmacogenetics en individuele gevoeligheid voor (bij)werking van geneesmiddelen Verschillende respons op een geneesmiddel door de variabiliteit in de mens → gewicht/bouw, zwangerschap, etniciteit, omgevingsfactoren, voeding etc. Extensive metabolizer= 100% werking van het CYP2D6 enzym. Intermediate metabolizer → 50% van het enzym CYP2D6 is actief. Ultrarapid metabolizer → Meerder dan 2 functionele allelen, heb je een goede CYP2D6 activiteit Allel wordt aangeduid met een * → *1 is het meest voorkomende, meest normaal. Toxicologie 63  Kleine verandering in het genotype, zoals Single nucleotide polymorfisme, kan leiden tot een gereduceerde of geen activiteit. Single nucleotide polymorfisme= DNA waarbij er 1 nucleotiden verschille