Técnicas Detección Bacteriana

Curso de Formación para la Promoción para Técnico de Laboratorio: Especialidad Bioexperimental

• El curso trata sobre los procedimientos de identificación bacteriana
• Se centra en la siembra, el aislamiento y las pruebas bioquímicas fundamentales

Grupos de Microorganismos

• Los microorganismos se dividen en procariotas, eucariotas y virus
• Los principales microorganismos incluyen bacterias (bacteriología), protozoos (protozoología), algas microscópicas (ficología), levaduras (unicelulares), mohos (micología), y virus (virología)

Identificación Bacteriana

• Técnicas fenotípicas y métodos genotípicos se utilizan para la identificación de bacterias
• El proceso incluye el examen microscópico de la muestra (observación en fresco/tinciones) y el aislamiento en cultivo puro (siembra en diferentes medios de cultivo)
• Se realizan pruebas bioquímicas para analizar enzimas metabólicas, requerimientos nutricionales, características macroscópicas y microscópicas
• El diagnóstico serológico también es parte del proceso
• Se parte de una MUESTRA, por ejemplo muestra de paciente

Observación de Bacterias y el Microscopio

• El microscopio revela un mundo de microbios antes desconocido
• El proceso de observación de bacterias también incluye la diversidad, tamaño y forma de las bacterias

Tamaño de las Bacterias

• Un procariota bacilar típico, como Escherichia coli, mide aproximadamente 1x2 μm
• La mayoría de los procariotas se encuentran en este rango de tamaño

Tamaño de los Procariotas

• Los procariotas muy grandes, como Epulopiscium fishelsoni (hasta 750μm visible a simple vista, y Thiomargarita namibiensis ) son poco comunes

Tipos de Microscopios

• El microscopio óptico se utiliza para observar células enteras a bajos aumentos
• Tipos de microscopios ópticos incluyen el microscopio óptico compuesto, campo claro, contraste de fases (para células vivas sin colorantes), campo oscuro y fluorescencia
• El microscopio electrónico se utiliza para observar estructuras internas, detalles de superficie y virus a grandes aumentos
• Tipos de microscopios electrónicos incluyen el de transmisión y el de barrido

Microscopio de Campo Claro

• El microscopio óptico generalmente permite aumentos de hasta 1000 veces el tamaño original del objeto
• Partes del microscopio incluyen ocular, objetivo, platina etc

Diversidad Morfológica Bacteriana

• Las células bacterianas varían en tamaño (grandes y pequeños) y grosor (delgados y gruesos)
• Los extremos de los bacilos pueden ser rectos, redondos o puntiagudos

Bacterias Espirales

• Las bacterias espirales tienen uno o más giros
• Tipos de bacterias espirales incluyen vibrios ("varillas curvadas"), espirilos (forma helicoidal "sacacorchos" y rígidos) y espiroquetas (forma helicoidal y cuerpos bastante flexibles)

Agrupaciones de los Cocos

• Los cocos pueden formar agrupaciones como diplococos (Streptococcus pneumoniae), estreptococos (Streptococcus pyogenes), tétradas (Micrococcus luteus), sarcinas (Sarcina ventriculi), y estafilococos (Staphylococcus aureus)

Agrupaciones de los Bacilos

• Los bacilos pueden formar agrupaciones como estreptobacilos (Bacillus megaterium) y Bacillus cereus

Técnicas de Observación: Microscopía de Campo Claro

• Las preparaciones en fresco (entre porta y cubre) se utilizan para observar microorganismos vivos sin teñir, aunque dificulta la observación
• Las preparaciones teñidas se utilizan para microorganismos muertos, utilizando colorantes básicos (catiónicos) y ácidos (aniónicos)
• El contraste es necesario ya que los procariotas son pequeños y contrastan poco con el medio, aunque algunos pigmentados son una excepción
• La tinción es una forma de mejorar el contraste empleando colorantes
• Tipos de tinciones incluyen la tinción simple (con un colorante básico como el azul de metileno), la tinción negativa (con colorantes ácidos) y las tinciones diferenciales (como la tinción de Gram, con dos colorantes básicos)

Pasos para la Realización de una Tinción

• Preparar un frotis o extensión: Extender una fina capa del cultivo sobre el portaobjetos (aprox. 1 cm2) y dejar secar al aire.
• Fijar mediante calor: Adherir las células al portaobjetos, conservando y fijando en su posición las estructuras internas y externas (conserva la estructura general)
• Teñir la muestra previamente fijada, añadir el colorante y lavar con H2O, dejar secar al aire
• Observar al microscopio con un objetivo 40X o 100X con aceite de inmersión
• El frotis se prepara de manera diferente según el tipo de cultivo inicial (en medio líquido o sólido)

Tinción Simple (Azul de Metileno)

• Utiliza un colorante básico

Tinción Negativa (Nigrosina)

• Utiliza un colorante ácido para observar cápsulas

Tinción Diferencial de Gram

• Se divide en cuatro pasos principales que tiñen las paredes celulares
• Colorante primario: Tinción del frotis fijado a la llama con cristal violeta
• Mordiente: Se forma un complejo CV-I insoluble, y todas las células permanecen de color violeta
• Decolorante: Decoloración breve con alcohol
• Las células Gram+ permanecen de color violeta, mientras que las Gram- se decoloran
• Contraste: Tinción de contraste con safranina, donde las Gram+ se ven violetas y las Gram- rosas

Tinción Diferencial de Gram (Han Cristian Gram, 1884)

• Las especies del dominio Bacteria se dividen en dos grandes grupos en base a la reacción frente a la tinción de Gram: gram positivos y gram negativos

Paredes Celulares Bacterianas: Gram + y Gram -

• La tinción de Gram permite diferenciar entre bacterias con diferentes estructuras de pared celular

Cocos Gram+ y Bacilos Gram-

• Ejemplos incluyen Staphylococcus aureus (Cocos Gram+) y Escherichia coli (Bacilos Gram-)

Técnicas de Cultivo de Microorganismos

• El propósito del cultivo de microorganismos es el de imitar su entorno para ayudar al crecimiento y reproducción,
• Los factores clave incluyen factores ambientales como nutrientes químicos y factores físicos-químicos
• Los factores físico-químicos son la temperatura, pH, concentración osmótica, y oxígeno molecular (O2)

Hábitats

• Los microorganismos pueden vivir en una gran variedad de lugares, como en el medio ambiente de la tierra y cuerpos de otros animales

Hábitats Extremos con Vida Microbiana

• Hay microorganismos que viven en hábitats extremos como chimeneas volcánicas, parque nacional, ambientes fríos etc

Estimaciones del número total de células microbianas en la Tierra

• 2 x 1030
• Forman la principal fracción de la biomasa en la tierra

O2 y Crecimiento Microbiano

• Tipos de microorganismos se relación con la presencia o no de oxígeno
• Diferentes aerobios con estrictos, facultativos o microaerófilos
• Anaerobios (estrictos o aerotolerantes)

Crecimiento y [O2]

• El crecimiento bacteriano se puede ver en diferentes partes del caldo
• Las bacterias tienen distintas relaciones con él

Tª y Crecimiento Microbiano

• T- La velocidad de crecimiento depende de la temperatura
• Temperaturas Cardinales: mínima, óptima y máxima

Clases de Microorganismos según la Tª

• La Tª óptima influye en la categoría de las bacterias
• Las principales clases son psicrófilo (baja), mesófilo (moderada), termófilo (alta), hipertermófilo (muy alta)
• Ningún eucariota crece por encima de los 60-65 grados

Mesófilos (Ej: Escherichia coli)

• Se encuentran en animales de sangre caliente y en ambientes acuáticos
• Crecen bien en un margen de 20-45ºC.

Termófilos

• Crecen a temperaturas >45ºC.

Hipertermófilos

• La Tª óptima es >80ºC y algunas crecen con Tas ≥100ºC

Psicrofilos

• Crecen a 0ºC, con Tª máximas ≤20ºC

pH y Crecimiento Microbiano

• pH ácidos es <7
• La mayoría de ambientes naturales tienen pH 5-9
• Clases: acidófilos, neutrófilos y alcalófilos
• ACIDÓFILOS: Crecen a pH ácidos con valores de pH óptimos entre 1 y 5,5.
• NEUTRÓFILOS: pH óptimos 6,5-7,5 (límites mínimos y máximos de crecimiento, 4-9).
• ALCALÓFILOS: pH óptimos entre 106,5-7,5
• El pH interno de la célula se mantiene cerca de la neutralidad

Importancia del Control del pH en los Cultivos Microbianos

• Tampón (buffer) FOSFATO utilizado
• Fórmulas: H++HPO42-→H2PO4- y OH-+H2PO4-→HPO42-+HOH

[NaCl] y Crecimiento Microbiano

• Utiliza tolerancias o requerimientos de sal
• NO HALÓFILAS: la mayoría de los microorganismos no toleran [NaCl] ≥1%.
• HALOTOLERANTES: soportan [NaCl] en torno al 5-10%. Crecen mejor sin ellas.
• HALÓFILOS: dependencia del ión Na+: 1-15%. Bacterias marinas: [NaCl] = 3%.
• HALÓFILOS EXTREMOS: crecen y dependen de [NaCl] entre 15-30%.

Clases y Ejemplos de Microorganismos Extremófilos

• La tabla clasifica los organismos extremófilos por tipo, género y especie.

Técnicas de Cultivo

• Para evitar la contaminación de los cultivos es necesario seguir unas técnicas microbiológicas
• Técnicas de cultivo y asepsia

Lista de Pasos

• Preparación del medio de cultivo
• Esterilización
• Siembra o inoculación
• Incubación

Inoculación de Medios de Cultivo

• Técnicas de transferencia aséptica: ASA y AGUJA DE SIEMBRA y PIPETAS AUTOMÁTICAS

Técnicas En Tipos De Medios

• Medio líquido(En tubo)
• Agar blanco(Para siembra x picadura en tubo)
• Medio Agaz sólido
• Placas De Petri (estria múltiple,Estrías por agotamiento)

Lista de Pruebas Bioquímicas

• Catalasa
• Oxidasa
• Ureasa
• Beta-galactosidasa
• Entre otras