50 Questions
Wat is het doel van recombinant DNA technologie?
Het veranderen van de genetische informatie van een organisme door de nucleotidesequentie van zijn genoom te wijzigen
Wat zijn GGO's?
Genetisch gemodificeerde organismen
Wat is een toepassing van recombinant DNA technologie?
Het creëren van nieuwe medicijnen en vaccins
Wat wordt bedoeld met DNA-fingerprinting?
Het identificeren van personen aan de hand van unieke DNA-patronen
Wat zijn restrictie-enzymen in het kader van recombinant DNA technologie?
Enzymen die DNA op specifieke plaatsen kunnen knippen
Wat is het doel van Southern Blotting in recombinant DNA technologie?
Het detecteren van specifieke DNA-sequenties in een monster
Wat is het resultaat van het inactiveren van lacZ' door insertie in de multiple cloning site (MCS)?
Onderbreking van het open leesraam (ORF) van β-galactosidase
Waardoor worden bacteriën met een geïnactiveerd β-galactosidase (door MCS-insertie) gekenmerkt op platen?
Ze zijn wit
Wat is het probleem met nucleases in relatie tot de vector-einden en MCS-inactivatie?
Afknaten van beide vector-einden en niet meer opnemen van inserts
Wat is een oplossing voor het probleem met vectoren zonder insert, zoals M13 en pUC 18/19?
Alkalisch fosfatase en twee verschillende restrictie-enzymen gebruiken (directional cloning)
Wat is een eigenschap van M13-fagen in relatie tot replicatie in E.coli?
Het resulteert in ssDNA
Wat is een eigenschap van cosmiden in relatie tot replicatie?
Replicatie met ori-replicatie van plasmide
Wat is een eigenschap van de pBluescript (pBS)-vector?
Gebruik bij RNA-transcriptie
Wat is een veelvoorkomende toepassing van genetisch gemodificeerde organismen (GGO's) in laboratoria?
Het maken van recombinante geneesmiddelen
Wat is een probleem bij het introduceren van vreemd recombinant DNA in cellen?
Cellen nemen vreemd DNA niet spontaan op
Hoe wordt vreemd recombinant DNA in bacteriën geïntroduceerd?
Het wordt vermomd in een plasmide en ingebracht in bacteriën
Waarom worden gistcellen (Saccharomyces cerevisiae) vaak gebruikt voor genetische modificatie?
Ze zijn eukaryoot en kunnen gemanipuleerd worden om bepaalde enzymen te missen
Wat is de functie van restrictie-enzymen?
Om het eigen DNA van organismen te beschermen tegen vreemd DNA
Wat is een toepassing van restrictie-enzymen?
DNA-fingerprinting door het knippen van DNA op welbepaalde plaatsen
Wat is gelelectroforese?
Een techniek om moleculen te scheiden op basis van hun grootte en lading
Wat wordt bedoeld met Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs)?
Verschillende knippatronen die ontstaan bij het gebruik van restrictie-enzymen
Hoe migreren DNA-fragmenten tijdens gelelectroforese?
Naar de positieve pool, omdat DNA negatief geladen is
Wat helpt bij de opzuivering tijdens affiniteitschromatografie bij gebruik van de pTrcHis expressievector?
Oligohistidine-expressie
Welk probleem kan optreden bij expressie van eukaryote eiwitten in bacteriën?
Posttranslationele modificaties ontbreken
Wat is een kenmerk van het baculovirus?
Belangrijkste eiwit is 'polyhedrine'
Welke gastheercel wordt vooral gebruikt om problemen bij expressie van eukaryote eiwitten in bacteriën te omzeilen?
Bakkersgist
Wat is een functie van de λgt11-vector?
Gebruik van anti-β-galactosidase antilichamen
Waarom kan expressie van eukaryote eiwitten in bacteriën problematisch zijn?
Posttranslationele modificaties ontbreken
Welk type genoom heeft het baculovirus?
Groot circulair dsDNA genoom
Wat is een functie van de shuttle-vector gebaseerd op de 2-micron-plasmide?
'Polyhedrine' expressie in eukaryote gastheercellen
Wat is de functie van Southern blotting?
Verplaatsen van DNA-fragmenten op een membraan
Waaruit bestaat het maken van cDNA?
Gebruik van reverse transcriptase en polymerase
Wat is klonen?
Het maken van grote aantallen identieke DNA-moleculen
Wat is een reden voor het veelvuldige gebruik van plasmiden als kloneringsvectoren?
Aanwezigheid van replicatiestartpunt
Wat is een kenmerk van pBR-plasmiden?
Bevat antibioticarestistentie-gen
Welke plasmide bevat een hogere copy number?
pUC-plasmide
Wat is de functie van het lacZ’-gen in pUC-plasmiden?
Codeert voor β-galactosidase
Wat is de rol van reverse transcriptase (RT) bij cDNA-synthese?
Maken van complementair DNA-strand
Naar welk type DNA maakt cDNA zich complementair?
Eukaryoot mRNA
Wat is de eerste stap in Southern blotting?
Knippen DNA met restrictie-enzymen
Wat is een functie van cosmiden als kloneringsvectoren?
Replicatiestartpunt
Wat is het doel van het merkteken voor selectie van de gewenste kloon in plasmiden?
Selectie van de gewenste kloon
Wat is een mogelijke reden waarom expressievectoren moeten beschikken over de juiste promotors?
Om ervoor te zorgen dat bacteriële enzymen de promotors kunnen herkennen en binden
Wat wordt gebruikt om de expressie van eukaryote eiwitten in een bacterie te sturen?
Sterke promotors en een goede ribosoom-bindingsplaats
Wat kan er gebeuren bij continue expressie van een vreemd eiwit in een gastheerbacterie?
De eigen groei en vermenigvuldiging van de bacterie kan onderdrukt worden
Wat zijn 'inclusion bodies' in het cytoplasma van een bacterie?
Plaatsen waar eukaryote eiwitten neerslaan
Waarom wordt cyanogeenbromide gebruikt bij de productie van het menselijk groeihormoon somatostatine?
Om de twee peptiden los te knippen van elkaar
Wat wordt gebruikt om complementaire sequenties aan de uiteinden van het gen te plakken?
Restrictie-enzymen (RE)
Wat is een kenmerk van YACs (Yeast Artificial Chromosomes)?
Ze bevatten gist telomeren, centromeer, gist origin of replication en merkergenen
Waarom werden BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) ontwikkeld?
Om kleine inserts te kloneren, tot 300kb, omdat ze veel stabieler zijn
Study Notes
- Door het aanwezigheid van het lacZ-gen kan men gewenste kolonies met vector en insert selecteren. Om de transcriptie te stimuleren, toegevoegd IPTG als inducer. In aanwezigheid van IPTG, bindt repressor van het lac-operon en transcriptie kan dus plaatsvinden. Om lekkage van het operon te voorkomen, is er een lacI-gen aanwezig op de vector, dat voor de repressor codeert. Als er geen inducer is, blijft er repressie van het lacZ-gen (of insert).
- Artificiele chromosomen als vectoren: YAC (Yeast Artificial Chromosomes), BAC (Bacterial Artificial Chromosomes), PAC (P1 Artificial Chromosomes). Ze kunnen grote inserts bevatten en werden gebruikt bij het Human Genome Project om het hele menselijke genoom te brengen in kaart. Net zoals natuurlijke chromosomen, repliceren artificiele chromosomen zich slechts één keer per celcyclus. YACs werden het eerst ontwikkeld en bevatten gist telomeren, centromeer, gist origin of replication, merkergen en MCS. YACs werden ontwikkeld om zeer grote inserts te kunnen kloneren (tot 1000kb). Omdat ze vaak instabiel waren en er recombineerden met de chromosomen van de gistcel, werden BACs ontwikkeld. BACs bevatten kleinere inserts (tot 300kb), maar ze zijn veel stabieler. BACs zijn gebaseerd op de F-factor van E. coli. Ze bevatten genen die ervoor zorgen dat er een replicatiecomplex gevormd kan worden, genen die elke dochtercel netjes een kopie meekrijgt en genen die men bij andere plasmiden terugvindt.
- Expressievectoren: geschikt om genen effectief tot expressie te brengen in hun gastheercel. Gastheercellen zijn vaak bacteriën. Dit geeft problemen als men eukaryote eiwitten tot expressie wil laten brengen. Expressievectoren moeten in het bezit zijn van de juiste promotoren die door bacteriële enzymen herkend en gebonden kunnen worden. Veel vectoren, zoals pUC en pBS, kunnen ook gebruikt worden voor expressie omdat ze in het bezit zijn van de lac-promotor. Ondertussen zijn er betere en meer gespecialiseerde expressievectoren ontwikkeld. Ze bevatten een sterke promotor en een goeie ribosoom-bindingsplaats. Vaak werkt men met induceerbare expressievectoren. De expressie van eukaryote eiwitten in een bacterie moet gestuurd gebeuren omdat eukaryote eiwitten toxisch kunnen zijn voor bacteriën. Bij de gastheerbacterie bij continue expressie van het vreemde eiwit, kan zijn eigen groei en vermenigvuldiging onderdrukt worden. Hierdoor is er een kleinere 'oogst'. Een ander voorkomend fenomeen is de vorming van 'inclusion bodies'. Dit zijn plaatsen in het cytoplasma van de bacterie waar de eukaryote eiwitten neerslaan.
- Productie van het menselijk groeihormoon somatostatine: men maakt het kunstmatige gen chemisch aan en bevat daarnaast ook een codon voor methionine aan het 5’ einde en twee stopcodons aan het andere uiteinde. Dit gen wordt in een plasmide vector ingebouwd. Men plakelt complementaire sequenties met de sticky ends van EcoRI en BamHI aan de uiteinden van het gen. De expressievector wordt dan ook met deze RE geknipt en het insert kan gemakkelijk ingebouwd worden. Het insert bevindt zich in het midden van het β-galactosidasegen, stroomafwaarts van de promotor, operator en ribosoom bindingsplaats. Men brengt deze vector met de gastheerbacterie in en de bacterie produceert een fusie-eiwit. Dit bestaat uit het somatostatinepolypeptide, gekoppeld aan een stuk van het β-galactosidase via een methionine residue. Behandeling met cyanogeenbromide zal de twee peptiden losknippen van elkaar. Eenmaal vrij is, kan het zich op de juiste manier plooien en geïsoleerd worden. Men kan de expressie van somatostatine reguleren omdat het onder controle staat van de lacpromotor.
- Problem met de lac-promotor: zij "lekt" (zelfs in aanwezigheid van geen inducer is er lichte expressie en dit gold ook voor het insert). Om de expressie van het insert te blokkeren (of juist te stimuleren vanaf nul), gebruikt men meestal een vector die zelf ook een lacI-gen bevat. Dit lacI-gen codeert voor de repressor van het lac-operon. De expressie zal pas op gang komen na toevoegen van IPTG als inducer.
- Andere promotors: trc-promotor (sterke trp-promotor en induceerbaarheid van de lac-promotor), P bad (zeer gevoelige en fijne controle van expressie, inducer is arabinose) en λ-faag promotor (geactiveerd bij hoge temperaturen), T7-faag promotor (zeer sterke en snel reagerende virale promotor).
- λ-faag promotor: gebruikbaar in gastheercellen met temperatuurgevoelig λrepressorgen. Bij lage temperaturen (32°C) is de repressor actief en is er dus geen expressie. Bij hoge temperaturen (42°C) is de repressor inactief en is er wel expressie. Een ander voorbeeld van een virale promotor is de T7-faag promotor.
Test your knowledge on X-gal screening and the use of the lacZ' marker gene in a vector. Understand the inactivation of the lacZ' gene by insertions in the multiple cloning site (MCS) and its impact on β-galactosidase production.
Make Your Own Quizzes and Flashcards
Convert your notes into interactive study material.
Get started for free
