42 Questions
Cuál es el papel del bloqueo en la inmunodetección de proteínas?
Evitar la unión del anticuerpo a la superficie de la membrana
¿Cuál es el color de las bandas cuando se utiliza Ponceau S?
Rojo o rosa
¿Qué sucede con la membrana después de la tinción con Amido Black?
No puede ser reutilizada
¿Cuál es el propósito de utilizar tintes como Ponceau S y Amido Black?
Comprobar la transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana
¿Cuál es el polo hacia el que migran las proteínas?
Polo positivo (ánodo)
¿Cuál es el método de transferencia que requiere menos buffer y menos tiempo?
Método semi-seco (semi-dry blot)
¿Qué tipo de interacciones se evitan mediante el bloqueo en la inmunodetección de proteínas?
Interacciones no específicas
¿Qué tipo de membrana se utilizará en este ensayo?
Membrana de nitrocelulosa
¿Cuál es el nombre del método que se refiere a la transferencia de proteínas separadas en un gel de poliacrilamida a una membrana?
Western Blot
¿Cuál es el resultado de la tinción con Amido Black?
Las bandas son de color negro
¿Qué es lo que se puede evaluar mediante la técnica de Western Blot?
Cambios químicos y modificaciones post-traducciónales en la proteína
¿Qué sucede con la tinción con Ponceau S después de un período de tiempo?
Desaparece rápidamente
¿Cuál es el orden correcto de los componentes en el montaje de la transferencia?
Electrodo con carga negativa; blotting paper; gel de poliacrilamida; membrana; blotting paper; electrodo con carga positiva
¿Por qué se utiliza el bloqueo en la inmunodetección de proteínas?
Para evitar la unión no específica del anticuerpo a la membrana
¿Cuáles son las membranas más comúnmente utilizadas?
Membranas de nitrocelulosa y de PVDF
¿Por qué se utiliza un campo eléctrico en el proceso de electrotransferencia?
Para mover las proteínas con carga negativa del gel de poliacrilamida a la membrana
¿Qué es lo que se utiliza para detectar la presencia de GAPDH humano en las muestras?
Un anticuerpo primario y secundario específico
¿Por qué se prefiere utilizar membranas de nitrocelulosa?
Porque son económicas, bloquean con facilidad y no requieren pretratamiento con metanol
¿Cuál es el objetivo principal de la optimización en la transferencia?
Lograr una transferencia exitosa
¿Cuál es el propósito de la tinción de Ponceau?
Confirmar la transferencia de proteínas totales del gel de poliacrilamida a la membrana
¿Cuál es el primer paso en un Western Blot?
La electrotransferencia
¿Qué factores influyen en la eficiencia de la transferencia?
Varios factores
¿Qué tipo de membrana se utiliza en la técnica de Western Blot?
Todas las opciones anteriores
¿Cuál es el objetivo de la transferencia de proteínas del citoplasma de las células PANC-1?
Detectar la presencia de GAPDH humano
¿Cuál es el propósito de teñir la membrana con Ponceau S?
Para visualizar las bandas de proteínas
¿Cómo se debe lavar la membrana después de teñirla?
Tres veces con 15 mL de TTBS low salt
¿Por qué es importante no agregar el tinte directamente sobre la membrana?
Para evitar la contaminación de la membrana
¿Cuál es el propósito del paso 15?
Para lavar la membrana con TTBS low salt
¿Qué se debe hacer con los desechos después de lavar la membrana?
Colocarlos en el recipiente designado
¿Cómo se debe cortar la membrana después de la tinción?
Con una tijera por la mitad
¿Qué se debe hacer con el instrumento después de la transferencia?
Vacié cualquier residuo de líquido del cassette y apagar el instrumento
¿Cuál es el propósito del mantenimiento del instrumento?
Para asegurar la función correcta del instrumento
¿Cuál es el propósito principal de la solución bloqueadora en este protocolo?
Reducir las reacciones no específicas del anticuerpo
¿Cuánto tiempo se deja incubar la membrana con el anticuerpo primario?
overnight
¿Por qué es importante realizar los lavados con TTBS low salt?
Para evitar interacciones no específicas
¿Cuál es la dilución del anticuerpo Anti-GAPDH?
1:2000
¿Cuántos mL de TTBS low salt se utilizan para los lavados?
15 mL
¿Cómo se prepara el anticuerpo secundario?
Calculando el volumen a utilizar del anticuerpo secundario
¿Cuál es la fórmula utilizada para calcular el volumen del anticuerpo secundario?
Volumen final/dilución = 10,000 µL/20,000 = 0.5 µL
¿Cuántos mL de anticuerpo secundario se utilizan para incubar la membrana?
10 mL
¿Qué pasa si no se realizan los lavados adecuados?
El fondo (background) aumenta
¿Por qué se utiliza leche desnatada en la solución bloqueadora?
Para reducir las reacciones no específicas del anticuerpo
Study Notes
Técnicas de Western Blot
- La transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana se puede comprobar utilizando tintes como Ponceau S y Amido Black.
- Ponceau S produce bandas de color rojo o rosa y es compatible con procedimientos de detección que utilizan anticuerpos.
- Amido Black produce bandas negras y es una tinción permanente, pero no es compatible con procedimientos de detección que utilizan anticuerpos.
Inmunodetección de Proteínas
- Los anticuerpos primario y secundario pueden unirse a la membrana directamente.
- El paso de bloqueo es necesario para prevenir interacciones no específicas entre la membrana y el anticuerpo.
- Existen diferentes soluciones bloqueadoras, como la leche desnatada, TBS 1X, 0.1% Tween.
Técnicas de Transferencia
- La transferencia de proteínas se puede realizar mediante dos métodos: transferencia semi-seca (semi-dry blot) o mojada (wet tank blot).
- La transferencia semi-seca requiere menor cantidad de buffer y toma menos tiempo, mientras que la transferencia mojada requiere más buffer y toma más tiempo.
Preparación de la Membrana
- La eficiencia de la transferencia del gel de poliacrilamida a la membrana depende de varios factores, como el tiempo de transferencia, voltaje, composición del buffer, porcentaje de poliacrilamida, grosor del gel y peso molecular de la proteína.
- Las membranas de nitrocelulosa y las de PVDF son las que se utilizan con mayor frecuencia.
- Las membranas de nitrocelulosa son económicas, bloquean con mayor facilidad y no requieren un pretratamiento con metanol.
Protocolo de Western Blot
- El primer paso es la electrotransferencia (electroblotting) de las proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana.
- Luego, se teñe la membrana con Ponceau S para confirmar la transferencia de proteínas totales.
- Se lava la membrana tres veces con agua ultrapura y se seca completamente.
- Se bloquea la membrana con una solución bloqueadora para reducir las reacciones no específicas del anticuerpo.
- Se incuba la membrana con el anticuerpo primario y luego con el anticuerpo secundario.
- Se realizan lavados con TTBS low salt para evitar interacciones no específicas.
Realiza un ejercicio de laboratorio para transferir proteínas totales del citoplasma de células PANC-1 a una membrana de nitrocelulosa utilizando SDS PAGE y tinción de Ponceau. Confirma la transferencia de proteínas de diferente peso molecular. Aprende sobre técnicas de biología molecular en este ejercicio práctico.
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