Western Blot Laboratory Exercise

Podcast

Play an AI-generated podcast conversation about this lesson

Questions and Answers

Cuál es el papel del bloqueo en la inmunodetección de proteínas?

Incrementar la sensibilidad de la detección

Evitar la unión del anticuerpo a la superficie de la membrana (correct)

Permitir la unión del anticuerpo a la superficie de la membrana

Reducir la especificidad del anticuerpo

¿Cuál es el color de las bandas cuando se utiliza Ponceau S?

Azul

Rojo o rosa (correct)

Verde

Negro

¿Qué sucede con la membrana después de la tinción con Amido Black?

Puede ser reutilizada varias veces

No puede ser reutilizada (correct)

Debe ser secada con aire

Debe ser lavada con agua

¿Cuál es el propósito de utilizar tintes como Ponceau S y Amido Black?

Comprobar la transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana Signup and view all the answers

¿Cuál es el polo hacia el que migran las proteínas?

Polo positivo (ánodo) Signup and view all the answers

¿Cuál es el método de transferencia que requiere menos buffer y menos tiempo?

Método semi-seco (semi-dry blot) Signup and view all the answers

¿Qué tipo de interacciones se evitan mediante el bloqueo en la inmunodetección de proteínas?

Interacciones no específicas Signup and view all the answers

¿Qué tipo de membrana se utilizará en este ensayo?

Membrana de nitrocelulosa Signup and view all the answers

¿Cuál es el nombre del método que se refiere a la transferencia de proteínas separadas en un gel de poliacrilamida a una membrana?

Western Blot Signup and view all the answers

¿Cuál es el resultado de la tinción con Amido Black?

Las bandas son de color negro Signup and view all the answers

¿Qué es lo que se puede evaluar mediante la técnica de Western Blot?

Cambios químicos y modificaciones post-traducciónales en la proteína Signup and view all the answers

¿Qué sucede con la tinción con Ponceau S después de un período de tiempo?

Desaparece rápidamente Signup and view all the answers

¿Cuál es el orden correcto de los componentes en el montaje de la transferencia?

Electrodo con carga negativa; blotting paper; gel de poliacrilamida; membrana; blotting paper; electrodo con carga positiva Signup and view all the answers

¿Por qué se utiliza el bloqueo en la inmunodetección de proteínas?

Para evitar la unión no específica del anticuerpo a la membrana Signup and view all the answers

¿Cuáles son las membranas más comúnmente utilizadas?

Membranas de nitrocelulosa y de PVDF Signup and view all the answers

¿Por qué se utiliza un campo eléctrico en el proceso de electrotransferencia?

Para mover las proteínas con carga negativa del gel de poliacrilamida a la membrana Signup and view all the answers

¿Qué es lo que se utiliza para detectar la presencia de GAPDH humano en las muestras?

Un anticuerpo primario y secundario específico Signup and view all the answers

¿Por qué se prefiere utilizar membranas de nitrocelulosa?

Porque son económicas, bloquean con facilidad y no requieren pretratamiento con metanol Signup and view all the answers

¿Cuál es el objetivo principal de la optimización en la transferencia?

Lograr una transferencia exitosa Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de la tinción de Ponceau?

Confirmar la transferencia de proteínas totales del gel de poliacrilamida a la membrana Signup and view all the answers

¿Cuál es el primer paso en un Western Blot?

La electrotransferencia Signup and view all the answers

¿Qué factores influyen en la eficiencia de la transferencia?

Varios factores Signup and view all the answers

¿Qué tipo de membrana se utiliza en la técnica de Western Blot?

Todas las opciones anteriores Signup and view all the answers

¿Cuál es el objetivo de la transferencia de proteínas del citoplasma de las células PANC-1?

Detectar la presencia de GAPDH humano Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de teñir la membrana con Ponceau S?

Para visualizar las bandas de proteínas Signup and view all the answers

¿Cómo se debe lavar la membrana después de teñirla?

Tres veces con 15 mL de TTBS low salt Signup and view all the answers

¿Por qué es importante no agregar el tinte directamente sobre la membrana?

Para evitar la contaminación de la membrana Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito del paso 15?

Para lavar la membrana con TTBS low salt Signup and view all the answers

¿Qué se debe hacer con los desechos después de lavar la membrana?

Colocarlos en el recipiente designado Signup and view all the answers

¿Cómo se debe cortar la membrana después de la tinción?

Con una tijera por la mitad Signup and view all the answers

¿Qué se debe hacer con el instrumento después de la transferencia?

Vacié cualquier residuo de líquido del cassette y apagar el instrumento Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito del mantenimiento del instrumento?

Para asegurar la función correcta del instrumento Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito principal de la solución bloqueadora en este protocolo?

Reducir las reacciones no específicas del anticuerpo Signup and view all the answers

¿Cuánto tiempo se deja incubar la membrana con el anticuerpo primario?

overnight Signup and view all the answers

¿Por qué es importante realizar los lavados con TTBS low salt?

Para evitar interacciones no específicas Signup and view all the answers

¿Cuál es la dilución del anticuerpo Anti-GAPDH?

1:2000 Signup and view all the answers

¿Cuántos mL de TTBS low salt se utilizan para los lavados?

15 mL Signup and view all the answers

¿Cómo se prepara el anticuerpo secundario?

Calculando el volumen a utilizar del anticuerpo secundario Signup and view all the answers

¿Cuál es la fórmula utilizada para calcular el volumen del anticuerpo secundario?

Volumen final/dilución = 10,000 µL/20,000 = 0.5 µL Signup and view all the answers

¿Cuántos mL de anticuerpo secundario se utilizan para incubar la membrana?

10 mL Signup and view all the answers

¿Qué pasa si no se realizan los lavados adecuados?

El fondo (background) aumenta Signup and view all the answers

¿Por qué se utiliza leche desnatada en la solución bloqueadora?

Para reducir las reacciones no específicas del anticuerpo Signup and view all the answers

Study Notes

Técnicas de Western Blot

La transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana se puede comprobar utilizando tintes como Ponceau S y Amido Black.
Ponceau S produce bandas de color rojo o rosa y es compatible con procedimientos de detección que utilizan anticuerpos.
Amido Black produce bandas negras y es una tinción permanente, pero no es compatible con procedimientos de detección que utilizan anticuerpos.

Inmunodetección de Proteínas

Los anticuerpos primario y secundario pueden unirse a la membrana directamente.
El paso de bloqueo es necesario para prevenir interacciones no específicas entre la membrana y el anticuerpo.
Existen diferentes soluciones bloqueadoras, como la leche desnatada, TBS 1X, 0.1% Tween.

Técnicas de Transferencia

La transferencia de proteínas se puede realizar mediante dos métodos: transferencia semi-seca (semi-dry blot) o mojada (wet tank blot).
La transferencia semi-seca requiere menor cantidad de buffer y toma menos tiempo, mientras que la transferencia mojada requiere más buffer y toma más tiempo.

Preparación de la Membrana

La eficiencia de la transferencia del gel de poliacrilamida a la membrana depende de varios factores, como el tiempo de transferencia, voltaje, composición del buffer, porcentaje de poliacrilamida, grosor del gel y peso molecular de la proteína.
Las membranas de nitrocelulosa y las de PVDF son las que se utilizan con mayor frecuencia.
Las membranas de nitrocelulosa son económicas, bloquean con mayor facilidad y no requieren un pretratamiento con metanol.

Protocolo de Western Blot

El primer paso es la electrotransferencia (electroblotting) de las proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana.
Luego, se teñe la membrana con Ponceau S para confirmar la transferencia de proteínas totales.
Se lava la membrana tres veces con agua ultrapura y se seca completamente.
Se bloquea la membrana con una solución bloqueadora para reducir las reacciones no específicas del anticuerpo.
Se incuba la membrana con el anticuerpo primario y luego con el anticuerpo secundario.
Se realizan lavados con TTBS low salt para evitar interacciones no específicas.

Studying That Suits You

Use AI to generate personalized quizzes and flashcards to suit your learning preferences.

Description

Realiza un ejercicio de laboratorio para transferir proteínas totales del citoplasma de células PANC-1 a una membrana de nitrocelulosa utilizando SDS PAGE y tinción de Ponceau. Confirma la transferencia de proteínas de diferente peso molecular. Aprende sobre técnicas de biología molecular en este ejercicio práctico.