Western Blot Laboratory Exercise
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Questions and Answers

Cuál es el papel del bloqueo en la inmunodetección de proteínas?

  • Incrementar la sensibilidad de la detección
  • Evitar la unión del anticuerpo a la superficie de la membrana (correct)
  • Permitir la unión del anticuerpo a la superficie de la membrana
  • Reducir la especificidad del anticuerpo

    • ¿Cuál es el color de las bandas cuando se utiliza Ponceau S?

  • Azul
  • Rojo o rosa (correct)
  • Verde
  • Negro

    • ¿Qué sucede con la membrana después de la tinción con Amido Black?

  • Puede ser reutilizada varias veces
  • No puede ser reutilizada (correct)
  • Debe ser secada con aire
  • Debe ser lavada con agua

    • ¿Cuál es el propósito de utilizar tintes como Ponceau S y Amido Black?

    <p>Comprobar la transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el polo hacia el que migran las proteínas?

    <p>Polo positivo (ánodo)</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el método de transferencia que requiere menos buffer y menos tiempo?

    <p>Método semi-seco (semi-dry blot)</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué tipo de interacciones se evitan mediante el bloqueo en la inmunodetección de proteínas?

    <p>Interacciones no específicas</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué tipo de membrana se utilizará en este ensayo?

    <p>Membrana de nitrocelulosa</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el nombre del método que se refiere a la transferencia de proteínas separadas en un gel de poliacrilamida a una membrana?

    <p>Western Blot</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el resultado de la tinción con Amido Black?

    <p>Las bandas son de color negro</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué es lo que se puede evaluar mediante la técnica de Western Blot?

    <p>Cambios químicos y modificaciones post-traducciónales en la proteína</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué sucede con la tinción con Ponceau S después de un período de tiempo?

    <p>Desaparece rápidamente</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el orden correcto de los componentes en el montaje de la transferencia?

    <p>Electrodo con carga negativa; blotting paper; gel de poliacrilamida; membrana; blotting paper; electrodo con carga positiva</p> Signup and view all the answers

    ¿Por qué se utiliza el bloqueo en la inmunodetección de proteínas?

    <p>Para evitar la unión no específica del anticuerpo a la membrana</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuáles son las membranas más comúnmente utilizadas?

    <p>Membranas de nitrocelulosa y de PVDF</p> Signup and view all the answers

    ¿Por qué se utiliza un campo eléctrico en el proceso de electrotransferencia?

    <p>Para mover las proteínas con carga negativa del gel de poliacrilamida a la membrana</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué es lo que se utiliza para detectar la presencia de GAPDH humano en las muestras?

    <p>Un anticuerpo primario y secundario específico</p> Signup and view all the answers

    ¿Por qué se prefiere utilizar membranas de nitrocelulosa?

    <p>Porque son económicas, bloquean con facilidad y no requieren pretratamiento con metanol</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el objetivo principal de la optimización en la transferencia?

    <p>Lograr una transferencia exitosa</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el propósito de la tinción de Ponceau?

    <p>Confirmar la transferencia de proteínas totales del gel de poliacrilamida a la membrana</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el primer paso en un Western Blot?

    <p>La electrotransferencia</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué factores influyen en la eficiencia de la transferencia?

    <p>Varios factores</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué tipo de membrana se utiliza en la técnica de Western Blot?

    <p>Todas las opciones anteriores</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el objetivo de la transferencia de proteínas del citoplasma de las células PANC-1?

    <p>Detectar la presencia de GAPDH humano</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el propósito de teñir la membrana con Ponceau S?

    <p>Para visualizar las bandas de proteínas</p> Signup and view all the answers

    ¿Cómo se debe lavar la membrana después de teñirla?

    <p>Tres veces con 15 mL de TTBS low salt</p> Signup and view all the answers

    ¿Por qué es importante no agregar el tinte directamente sobre la membrana?

    <p>Para evitar la contaminación de la membrana</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el propósito del paso 15?

    <p>Para lavar la membrana con TTBS low salt</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se debe hacer con los desechos después de lavar la membrana?

    <p>Colocarlos en el recipiente designado</p> Signup and view all the answers

    ¿Cómo se debe cortar la membrana después de la tinción?

    <p>Con una tijera por la mitad</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se debe hacer con el instrumento después de la transferencia?

    <p>Vacié cualquier residuo de líquido del cassette y apagar el instrumento</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el propósito del mantenimiento del instrumento?

    <p>Para asegurar la función correcta del instrumento</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el propósito principal de la solución bloqueadora en este protocolo?

    <p>Reducir las reacciones no específicas del anticuerpo</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuánto tiempo se deja incubar la membrana con el anticuerpo primario?

    <p>overnight</p> Signup and view all the answers

    ¿Por qué es importante realizar los lavados con TTBS low salt?

    <p>Para evitar interacciones no específicas</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la dilución del anticuerpo Anti-GAPDH?

    <p>1:2000</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuántos mL de TTBS low salt se utilizan para los lavados?

    <p>15 mL</p> Signup and view all the answers

    ¿Cómo se prepara el anticuerpo secundario?

    <p>Calculando el volumen a utilizar del anticuerpo secundario</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la fórmula utilizada para calcular el volumen del anticuerpo secundario?

    <p>Volumen final/dilución = 10,000 µL/20,000 = 0.5 µL</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuántos mL de anticuerpo secundario se utilizan para incubar la membrana?

    <p>10 mL</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué pasa si no se realizan los lavados adecuados?

    <p>El fondo (background) aumenta</p> Signup and view all the answers

    ¿Por qué se utiliza leche desnatada en la solución bloqueadora?

    <p>Para reducir las reacciones no específicas del anticuerpo</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Técnicas de Western Blot

    • La transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana se puede comprobar utilizando tintes como Ponceau S y Amido Black.
    • Ponceau S produce bandas de color rojo o rosa y es compatible con procedimientos de detección que utilizan anticuerpos.
    • Amido Black produce bandas negras y es una tinción permanente, pero no es compatible con procedimientos de detección que utilizan anticuerpos.

    Inmunodetección de Proteínas

    • Los anticuerpos primario y secundario pueden unirse a la membrana directamente.
    • El paso de bloqueo es necesario para prevenir interacciones no específicas entre la membrana y el anticuerpo.
    • Existen diferentes soluciones bloqueadoras, como la leche desnatada, TBS 1X, 0.1% Tween.

    Técnicas de Transferencia

    • La transferencia de proteínas se puede realizar mediante dos métodos: transferencia semi-seca (semi-dry blot) o mojada (wet tank blot).
    • La transferencia semi-seca requiere menor cantidad de buffer y toma menos tiempo, mientras que la transferencia mojada requiere más buffer y toma más tiempo.

    Preparación de la Membrana

    • La eficiencia de la transferencia del gel de poliacrilamida a la membrana depende de varios factores, como el tiempo de transferencia, voltaje, composición del buffer, porcentaje de poliacrilamida, grosor del gel y peso molecular de la proteína.
    • Las membranas de nitrocelulosa y las de PVDF son las que se utilizan con mayor frecuencia.
    • Las membranas de nitrocelulosa son económicas, bloquean con mayor facilidad y no requieren un pretratamiento con metanol.

    Protocolo de Western Blot

    • El primer paso es la electrotransferencia (electroblotting) de las proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana.
    • Luego, se teñe la membrana con Ponceau S para confirmar la transferencia de proteínas totales.
    • Se lava la membrana tres veces con agua ultrapura y se seca completamente.
    • Se bloquea la membrana con una solución bloqueadora para reducir las reacciones no específicas del anticuerpo.
    • Se incuba la membrana con el anticuerpo primario y luego con el anticuerpo secundario.
    • Se realizan lavados con TTBS low salt para evitar interacciones no específicas.

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    Description

    Realiza un ejercicio de laboratorio para transferir proteínas totales del citoplasma de células PANC-1 a una membrana de nitrocelulosa utilizando SDS PAGE y tinción de Ponceau. Confirma la transferencia de proteínas de diferente peso molecular. Aprende sobre técnicas de biología molecular en este ejercicio práctico.

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