Transformace rostlin: Metody a aplikace

Transformace rostlin – Definice

• Transformace rostlin zahrnuje genetickou manipulaci.
• Spočívá ve vnášení cizorodého genetického materiálu do rostlin, pletiv nebo buněk.

Metody Transformace Rostlin

• Metody transformace rostlin se dělí na nepřímé (vektorem zprostředkované) a přímé.
• Mezi nepřímé metody patří "In Planta" a pletivové kultury.
• Mezi přímé metody patří elektroporace, mikroinjekce DNA, PEG, mikroprojektilova metoda, lipozómy, cesta pylové láčky a silikon karbidové vlákna.

Transientní transformace

• Při transientní transformaci nedochází k integraci vnesené DNA do genomové DNA.
• Vnesený gen se nereplikuje a postupně vymizí, dochází však k jeho přepisu a vzniku proteinu.
• Transientní transformace se využívá pro předběžné testování efektu vnesených genů.

Stabilní transformace

• Při stabilní transformaci dochází k integraci do genomu, což vede k dědičné změně genetické výbavy.
• Sílu exprese transgenu ovlivňuje typ promotoru, místo integrace a počet kopií.

Přímý přenos DNA - Fyzikální metody

Elektroporace

• Elektroporace spočívá ve využívání vysokonapěťových elektrických impulzů k reverzibilní permeabilizaci plazmatické membrány pro příjem DNA protoplasty.

• Využívá se k transformaci intaktních buněk, kalusových buněk a nezralých embryí obilovin (rýže, pšenice, kukuřice).

• Během elektroporace dochází k tvorbě elektropórů pod vlivem elektrického impulsu a opětovnému uzavření po impulsu.

• Výhody elektroporace zahrnují jednoduchost, rychlost, efektivitu z hlediska nákladů a zachování stejného fyziologického stavu transformovaných buněk.

• Účinnost transformace může být zlepšena optimalizací elektrické intenzity a přidáváním spermidinu.

• Omezení elektroporace zahrnují nízké množství vpravované DNA, vysokou variabilitu v závislosti na rostlinném materiálu a obtížnou regeneraci rostlin (zejména jsou-li použity protoplasty).

Mikroprojektilova metoda (Biolistická transformace)

• Mikroprojektilova metoda spočívá v mikroprojektilovém přenosu DNA (particle bombardment, gene gun).

• Patří k nejúčinnějším fyzikálním metodám pro přímý přenos cizorodé DNA do rostlinných buněk.

• Je univerzální a používána u mikroorganismů a savčích buněk.

• U rostlin se používá zejména u jednoděložných rostlin (listy, kořeny, meristematické pletiva, nezralá embrya, buněčné suspenze, kalusové kultury, pyl, mikrospory).

• Za přetlaku helia je vstřelována cizorodá DNA do rostlinného pletiva, které je během vlastní transformace ve vakuu.

• Mikročástice platiny, zlata nebo wolframu se využívají jako nosiče DNA.

• Využívá se na transientní studii exprese genů, analysu promotorů a genových delecí a studium mechanismů exprese.

• Výhody bombardování částicemi umožňují efektivní přenos genů na organizovaných pletivech a využití různých druhů rostlin k vytvoření transgenních rostlin.

• Limitace bombardování částicemi zahrnují vysoký počet kopií transgenu, časté poškození cílových pletiv a regeneraci nežádoucích chimérických rostlin.

Mikroinjekce

• Mikroinjekce je přímá fyzikální metoda zahrnující mechanické vložení žádoucí DNA do cílové buňky.
• Cílová buňka může být intaktní buňka, protoplast, kalus, embryo nebo meristém.
• Používá se pro přenos buněčných organel a pro manipulaci chromozomů.
• Technika zahrnuje imobilizování cílové buňky v agaróze (pomocná pipety, mikromanipulátor) a přenos genu pomocí mikropipety (0.5-10.0 pm na špici) do cytoplazmy, jádra rostlinné buňky nebo protoplastu.

PEG (polyethylén glykol)

• PEG je chemická metoda, která v přítomnosti dvojmocných kationtů (Ca2+) destabilizuje plasmatickou membránu protoplastů, čímž se stává propustnou pro DNA.
• DNA vstupuje do jádra protoplastů a integruje se do genomu.
• Je nutná izolace protoplastů, přidání plazmidové DNA, následované pozvolným přidáváním 40% PEG-4000 (w/v).
• Výhody PEG-zprostředkované transformace umožňují transformování velkého počtu protoplastů současně a využití pro širokou škálu rostlinných druhů.
• Nevýhodami jsou citlivost DNA na degradaci, náhodná integrace cizí DNA do genomu a obtížná regenerace rostlin z transformovaných protoplastů.

Liposomy

• Liposomy jsou uměle vytvořené lipidové vezikuly obsahující fosfolipidovou membránu.

• Úspěšně se používají k dodávání proteinů, léků do savčích buněk.

• Liposomy nesoucí geny mohou být použity pro fúzování s protoplasty a přenos genů.

• Účinnost transformace se zvyšuje, když se proces provádí ve spojení s PEG.

• Transformace zprostředkovaná liposomy zahrnuje adhezi liposomů k povrchu protoplastu, její fúzi v místě připojení a uvolňování plazmidů uvnitř buňky.

• DNA v liposomech je chráněna před nukleázami a poškozením životního prostředí.

• Liposomy zajišťují stabilitu DNA a možnost uložení před přenosem. Mají také dobrou reprodukovatelnost.

• Fúze liposomů se pojí s obtížností regenerací rostlin z transformovaných protoplastů.

Nepřímé metody transformace - Vektorem zprostředkovaný přenos genů

• Patří sem transfer pomocí Agrobacterium a rostlinné virové vektory.

Transfer pomocí Agrobacterium

• Některé druhy půdních bakterií, jako Agrobacterium, Rhizobium, Azorhizobium a Bradyrhizobium, indukují morfogenetické změny rostlin.

• Prokázaly jedinečnou schopnost řídit horizontální genetickou výměnu mezi rozdílnými fylogenetickými říšemi.

• Bakterie Rhizobium, Azorhizobium a Bradyrhizobium jsou trvalou součástí pletiv kořenových hlízek u leguminóz po jejich infikování.

• Pouze rod Agrobacterium je schopen přenášet specifické geny bakterií do genomu mnoha dvouděložných a některých nahosemenných rostlin.

• Agrobacterium tumefaciens je půdní patogenní bakterie, která indukuje nádorové útvary (crown gall) v místech poranění rostlin a napadá jakékoliv pletivo většiny dvouděložných rostlin.

• Mezi druhy rodu Agrobacterium patří: A. tumefaciens, A. rhizogenes, A. vitis (infikuje vinnou révu), A. rubi (infikuje maliník) a A. radiobacter (avirulentní).

• Poprvé se objevila zmínka o bakterii jako o původci tumoru na rostlinách roku 1907 (Smith and Townsend).

• Výzkum se zaměřoval na pochopení mechanizmu onkogeneze s cílem tvorby vhodných léčiv.

• Agrobacterium tumefaciens má jedinečnou schopnost přenosu segmentu DNA (T-DNA, transferred DNA) z tumor indukujícího (Ti) plazmidu do jádra infikované rostlinné buňky a stabilně integrovat do genomu hostitele.

• T-DNA nese onkogeny (kódují enzymy zapojené do syntézy auxinů a cytokininů a zodpovědní za tvorbu tumoru) a geny opinové syntézy (opiny jsou využívány bakterií jako zdroj C a N).

• Mimo T-DNA se nacházejí geny pro opinový katabolismus a geny zúčastňující se transferu T-DNA z bakterie do rostlinné buňky.

• Ti plasmid má velikost ≥200 kb, T-DNA má velikost 15-30 kb.

• Nasyntetizované hormóny proliferace rostlinných buněk, agropiny slouží bakterii jako zdroj uhlíku a energie.

• Agrobacterium tumefaciens geneticky transformuje rostlinné buňky a biosynteticky vyrábí živiny.

• Do rostlinné buňky se přenáší jenom T-DNA a vir geny, samotné geny pro opinový katabolismus se nepřenáší.

• Virulentní oblast obsahuje 6 operonů esenciálních pro transfer T-DNA (virA, virB, virD a virG).

• V cytoplazmě rostlinné buňky pokryje T-DNA VirE2 proteiny, které ho chrání před nukleázami.

• T-DNA je transportována do jádra pomocí proteinů VirD2 a VirE2.

• V jádře se Vir proteiny od řetězce odpojí a T-řetězec se začlení do genomu hostitelské rostlinné buňky.

• Na přenos T-komplexu se využívá pravděpodobně aktinový cytoskeleton.

• Před integrací se T-DNA se přemění z jednovláknové DNA na dvojvláknovou (dsDNA).

• Včlenění T-DNA v genomové DNA vyvolá na náhodném místě dvojřetězcový zlom.

• Ligace se uskuteční mezi genomovou DNA a T-DNA pomocí opravných mechanizmů dvojřetězcových zlomů.

• Analogií tohoto druhu je Agrobacterium rhizogenes, který přenáší segment T-DNA ze svého plazmidu indukujícího kořeny (Ri) do genomu infikovaných rostlinných buněk.

• Po expresi genů pro kořenový lokus (rol) je biosyntéza auxinu a cytokininu modifikována způsobem, který podporuje rychlou proliferaci adventivních kořenů.

• Fenotyp transformovaných kořenů má strukturu podobnou kořenům divokého typu, ale vyznačuje se rychlým růstem nezávislým na hormonech.

• Nepříma transformace využívá Agrobacteriem zprostředkovaný přenos genů.

• Patří k nejrozšířenější technice pro transformaci rostlin a generování transgenních rostlin.

• Využívá A. tumefaciens s vhodným binárním (superbinárním) vektorem.

• Konstrukce transformačních vektorů jsou založeny na původním Ti-plazmidu, z kterého byly odstraněny geny pro tvorbu fytohormonů a opinů.

• Mezi hraniční sekvence T-DNA je vložena cizorodá DNA, kterou chceme integrovat do rostlinného genomu a nevyžaduje se přítomnost specifické sekvence, jenom hraniční

• 2 typy transformačních vektorů - intermediální a binární vektory.

Intermediární (kointegrativní) vektory

• Jsou malé plazmidy s krátkými úseky, s levou a pravou hraniční sekvenci.
• Vkládá se sem zde je zájmový gen a gen selekční.
• Jsou schopny replikace jenom v E. coli, nikoliv v Agrobacterium.
• Do Agrobacterium se vnesou transformaci nebo konjugací a udrží se v buňkách ve kterých došlo k rekombinaci mezi homologními sekvencemi Ti plazmidu a intermediálního vektoru.

Binární vektory

• Princip konstrukce binárních vektorů je rozdělení velice rozsáhlého Ti plazmidu na dva plazmidy menší, úsek virulence a T-DNA nejsou společně přítomny na jednom plazmidu
• Menší plazmid – klonovací - obsahuje hraniční sekvence T-DNA, mezi ně se naklonuje DNA určená k přenosu a selekční gen.
• Větší plazmid - pomocný - nese větší část Ti-plazmidu a obsahuje všechny geny potřebné pro infekci hostitele a přenos T-DNA.

Superbinární vektory

• Tyto vektory obsahují T-DNA a některé geny z vir oblasti.
• Zvyšují účinnost transformace a mají klíčovou roli v 90. letech při transformaci obilovin pomocí Agrobacterium.

Obecný transformační protokol

• Příprava Agrobacterium nesoucí co-integrovaný nebo binární vektor se zájmovým genem.
• Výběr vhodného explantátu (buňky, protoplasty, pletiva, orgány).
• Ko-kultivace explantátů s Agrobacterium – minuty až dni.
• Eliminace Agrobacterium s vhodným antibiotikem bez poškození rostlinné tkáně.
• Selekce transformovaných rostlinných buněk.
• Regenerace celých rostlin nesoucích stabilně integrovaný transgén (ověření pomocí PCR, Southern blot).

Agrobacterium zprostředkovaného přenosu genů:

• Zajištění přirozeného způsobu přenosu genů a infikování jakýkoliv explantát (buňky/pletiva/orgány).
• Umožňuje stabilita přenesené DNA. Transformované rostliny se mohou účinně regenerovat.

Limitace Agrobacterium- zprostředkované transformace:

• Zajišťuje omezení hostitelských rostlin, protože mnohé plodiny (jednoděložné - obiloviny) nejsou přirozeně infikovány.

• Byly ale vyvinuty virulentní kmeny Agrobacterium, které mohou infikovat široké spektrum rostlin včetně obilovin.

• Buňky se efektivněji regenerují je ale obtížné transformovat (např. embryonální buňky leží v hlubokých vrstvách, které jsou těžko přístupné pro Agrobacterium).

• Agrobacteriem zprostředkovaná transformace jednodělož. rostlin se uskutečnila 10 let po první úspěšné transformaci dvouděložných (Barton 1983 vs. rýže, al. 1993).

• Mikroprojektilová metoda – je nejpoužívanější u jednoděložných rostlin.

• Umožňuje přímí transfer DNA do různých kompartmentů rostlinných druhů bez změny jejich regenerační schopnosti a buněčných typů.

Anatomické rozdíly vedou k rozdílné transformaci u jednoděložných a dvouděložných rostlin:

• Anatomické rozdíly mezi M/D v složení BS - D - glukany a xyloglukany; M arabinoxylany a xylóza, nepřítomnost/nízká hladina fenolických exudátů (stimulátory/inhibitory), extrémně slabá odpověď na poranění D turomovité pletivo;
• M rychlá tvorba lignifikovaného/slerecnchymatického prstence.
• Indukce vir genů a metylace (inaktivace transgenu u M vyšší, rozdílná regenerační schopnost. In Planta transformace floral-dip

Ponoření poupat/květů rostliny do buněčné suspenze s Agrobacterium pro zlepšení smáčivosti média

• T-DNA se dostává do samičího gametofytu a přes vajíčko se transgen přenáší do další generace.
• Semena vyprodukovaná z T1 rostlin se označují jako T2 generace být. Heterozygotní, homozygotní a nebo nemusí obsahoat transgén.
• Rostliny mohou být suspenzí stříkány a ponořovány. Je využíti u velkých roslinných druhů.

Selekce transformovaných rostlin

Součástí vektorů jsou selekcní geny, jenž se exprimují v rostlinných buňkách (gen pro rezistenci ke kanamycinu/hygromycinu nebo herbicidu fosfinotrycinou-selektabilní markery) Reporteory -GUS/GFP

Virové vektory použití v metodě. Nepřímý

• Virové vektory mají vložen gen do genomu a jsou-li vhodně použity jsou neintegrativní a přirozeně exprimují genetickou informaci.
• Gen může být produkován rychle s s vysokým výtěžkem, nemají začlenění do genomu a produkce proteinů má farmaceutický význam..
• Transfer má vysokou účinnost, probíhá replikací genomu a existují v systémovém šíření (velký počet kopií v cílových buňkách a integrativní vektory - A. tumefaciens)

Vektory se dělí na 1. A 2. Generace

• U vektorů 1 generace docházi k průniku do celého viru a jsou vhodné pro ucpavaní delších polypeptidů za použití pro infekci kopie nukleové kyseliny a postřik se směsí na poli s abrazivem.
• Aplikace mají omezení u first generation a asynchronní šíření-infekce postupuje rozdílně a většinou jsou tkáně nestabilní
• U vektorů 2. Generace je to více cíleno a a jednoduché řešení = odstranění obalového proteinů a může doručit virový lektor. Využívá se Agrobacterium a délka tranformace zálězí na vektori (4dní-10dní) Délka má vliv na výtěžku (Až g/kg )!
• U virových vektorů 2. generace není gen obalobého proteinu a může exprimovat delší geny(Až 80 kDa)
• Mají reaktivnogenní aminokyselinu - Usnadnění konjugací proteinů do virového proteinů
• Alternativou je použít A. jako nosič virových replikonů(PVC, X replilkonů . A využívají magnifekci. A vakove ponořením.. S vysoce zředěnou suspenzí, která Nese virový replicon DNA
• Magnifekce- Vyznačuje se výhodami: Rychlostí exprese, transfekcní účinnosti a nízké výrobní náklady
• Byla použita na humánní růstový hormon, protiláky a monoklonální anti-ebola anti látky (Firma Icongentics!!!) www.icongenetics.com