Transformace rostlin

Transformace rostlin

• Rostlinná transformace zahrnuje genetickou manipulaci.
• Zahrnuje zavádění cizorodého genetického materiálu do rostlin, pletiv nebo buněk.

Metody transformace rostlin

• Existují nepřímé a přímé metody transformace rostlin.
• Nepřímé metody využívají vektory pro přenos genů.
• Přímé metody zahrnují přímý přenos DNA.
• Nepřímé metody zahrnují in planta transformaci a pletivové kultury.
• In planta metody: Vakuová infiltrace, injektáž Agrobacteria, cesta pylové láčky, floral-dip, floral-spray.
• Pletivové kultury: Pletivové kultury, stonkové meristémy, vakuová infiltrace a sonifikace.
• Přímý přenos DNA: Elektroporace, mikroinjekce DNA, PEG (polyethylen glykol), mikroprojektilová metoda, lipozomy, cesta pylové láčky, silikon karbidové vlákna
• Exihují transientní a stabilní transformace rostlin.

Transientní Transformace

• Nedochází k integraci vnesené DNA do genomu hostitele.
• Vnesený gen se nereplikuje a postupně vymizí, ale dochází k jeho přepisu a tvorbě proteinu.
• Využívá se pro předběžné testování efektu vnesených genů.

Stabilní Transformace

• Dochází k integraci do genomu a dědičné změně genetické výbavy.
• Sílu exprese transgenu ovlivňuje typ promotoru, místo integrace a počet kopií.

Přímý přenos DNA

• Elektroporace využívá vysokonapěťové elektrické impulzy k reverzibilní permeabilizaci plazmatické membrány pro příjem DNA protoplasty.
• Elektroporace se využívá i na transformaci intaktních buněk, kalusových buněk a nezralých embryí obilovin (rýže, pšenice, kukuřice).
• Membrána před elektrickým impulzem (A), tvorba elektropórů pod vlivem elektrického impulsu (B) a opětovné uzavření a obnovení po impulsu (C).
• Elektroporace je jednoduchá, pohodlná, rychlá a efektivní z hlediska nákladů.
• Transformované buňky jsou ve stejném fyziologickém stavu po elektroporaci.
• Účinnost transformace je možné zlepšit optimalizací elektrické intenzity a přidáváním spermidinu.
• Za normálních podmínek je množství vpravované DNA do rostlinných buněk elektroporací velmi nízké.
• Účinnost elektroporace je vysoce variabilní v závislosti na rostlinném materiálu a podmínkách zpracování.
• Regenerace rostlin není snadná, zejména pokud jsou použity protoplasty.

Mikroprojektilova Metoda

• Mikroprojektilova metoda je transformační metoda používající mikroprojektilový přenos DNA (particle bombardment, gene gun).
• Patří mezi nejefektivnější fyzikální metody pro přímý přenos cizorodé DNA do rostlinných buněk.
• Je univerzální a používá se u mikroorganismů i savčích buněk.
• Používá se u rostlin, zejména jednoděložných rostlin – listy, kořeny, meristematická pletiva, nezralá embrya, buněčné suspenze, kalusové kultury, pyl a mikrospory.
• Princip: Cizorodá DNA je vstřelována do rostlinného pletiva pod tlakem helia ve vakuu.
• Jako nosiče DNA se používají mikročástice platiny, zlata nebo wolframu.
• Využívá se na transientní studii exprese genů, analýzu promotorů a genových delecí i studium mechanismů exprese.
• Přenos genů může být efektivně proveden na organizovaných pletivech, přičemž lze použít různé druhy rostlin k vytvoření transgenních rostlin.
• Nevýhody: Vysoký počet kopií transgenu může vést k nestabilitě exprese transgenu a časté poškození cílových pletiv v důsledku nedostatku kontroly rychlosti bombardování a občasná regenerace nežádoucích chimérických rostlin.

Mikroinjekce

• Mikroinjekce je přímá fyzikální metoda zahrnující mechanické vložení DNA do cílové buňky.
• Cílová buňka může být intaktní buňka, protoplast, kalus, embryo nebo meristém.
• Používá se pro přenos buněčných organel a pro manipulaci chromozomů.
• Zahrnuje imobilizování cílové buňky v agaróze a přenos genu pomocí mikropipety do cytoplazmy, jádra rostlinné buňky nebo protoplastu.

PEG (Polyethylen Glykol)

• V přítomnosti dvojmocných kationtů (Ca2+), destabilizuje plasmatickou membránu protoplastů, čímž se stává propustnou pro DNA.
• DNA vstupuje do jádra protoplastů a integruje se do genomu.
• Je nutná izolace protoplastů, přidání plazmidové DNA a následné pomalé přidávání 40% PEG-4000 (w/v).
• Současně může být transformován velký počet protoplastů a lze ji využít pro širokou škálu rostlinných druhů.
• DNA je citlivá na degradaci a náhodná integrace cizí DNA do genomu může mít za následek vznik nežádoucích vlastností a obtížnou regeneraci rostlin z transformovaných protoplastů.

Lipozomy

• Lipozomy jsou uměle vytvořené lipidové vezikuly s fosfolipidovou membránou.
• Lipozomy se úspěšně používají k dodávání proteinů, léčiv apod. do savčích buněk.
• Lipozomy nesoucí geny mohou být použity pro fúzování s protoplasty a přenos genů.
• Účinnost transformace se zvyšuje, když se proces provádí ve spojení s PEG.
• Transformace zprostředkovaná liposomy zahrnuje adhezi liposomů k povrchu protoplastu, její fúzi v místě připojení a uvolňování plazmidů uvnitř buňky.
• DNA v liposomech je chráněna před nukleázami a poškozením životního prostředí.
• DNA je stabilní a může být před přenosem uložena po určitou dobu v liposomech (dobrá reprodukovatelnost).
• Omezení fúze liposomů: obtížnost spojená s regenerací rostlin z transformovaných protoplastů.

Nepřímé metody: Vektorem zprostředkovaný přenos genů

• Transfer pomocí Agrobacterium a rostlinné virové vektory
• Některé druhy půdních bakterií (rod Agrobacterium, Rhizobium, Azorhizobium a Bradyrhizobium) indukují morfogenetické změny rostlin.
• Jedinečná přirozená schopnost řídit horizontální genetickou výměnu mezi rozdílnými fylogenetickými říšemi.
• Bakterie Rhizobium, Azorhizobium a Bradyrhizobium – ve formě bakteroidů – jsou trvalou součástí pletiv kořenových hlízek u leguminóz po infikování.
• Jenom u rodu Agrobacterium – přenos specifických genů bakterií do genomu mnoha dvouděložných a některých nahosemenných rostlin.
• Transformace zprostředkovaná Agrobacterium tumefaciens je nejpoužívanější metoda přenosu cizích genů do rostlinných buněk
• Agrobacterium tumefaciens je půdní patogenní bakterie přirozeně se vyskytující v kořenovém systému bobovitých rostlin.
• V místech poranění se tvoří tumorové útvary (crown gall).
• Je schopné napadat jakékoliv pletivo většiny dvouděložných rostlin.
• Do rodu Agrobacterium patří druhy: A. tumefaciens, A. rhizogenes, A. vitis, A. rubi a A. radiobacter.
• První zmínka o Agrobacterium, jako o původci tumoru na rostlinách, byla v roce 1907 (Smith a Townsend).
• První fáze výzkumu Agrobacteria se zaměřovala na pochopení mechanizmu onkogeneze s cílem tvorby vhodných léčiv.
• Druhá fáze výzkumu zjistila, že tumorové útvary jsou výsledkem přenosu genů z Agrobacterie do poraněných rostlinných buněk.
• A. tumefaciens má jedinečnou schopnost přenosu segmentu DNA (T-DNA) z tumor indukujícího (Ti) plazmidu do jádra infikované rostlinné buňky, stabilně integrován do genomu hostitele.
• T-DNA nese 2 typy genů: onkogeny + geny opinové syntézy.
• Onkogeny kódují enzymy zapojené do syntézy auxinů a cytokininů a zodpovědní za tvorbu tumoru.
• Geny opinové syntézy kódují opiny, které je bakterie využívá jako zdroj C a N.
• Ti plasmid – ≥200 kb, T-DNA – 15-30 kb.
• Virulentní oblast Agrobacteria má 6 operonů, jsou esenciální pro transfer T-DNA (virA, virB, virD a virG) a pro zvýšení eficience transferu (virF a virE).
• Rostliny nepřirozeně nesyntetizují ani nemetabolizují agropiny.
• Agropiny jsou využívány bakterií jako zdroj uhlíka a energie
• T-DNA nese tři nové rostlinné metabolity (opiny) - oktopin a nopalin (deriváty aminokyselin) a agropin (derivát cukru).
• A. tumefaciens geneticky transformuje rostlinné buňky, aby vytvářela biosyntetické zařízení pro výrobu živin pro vlastní použití.

Transformace zprostředkovaná Agrobacterium tumefaciens:

• VirA, VirG, vir region , Ti, T-DNA, left borders a right
• Přenos T-komplexu se využívá pravděpodobně aktínový cytoskeleton

A. rhizogenes

• A. rhizogenes - analogicky k Agrobacterium tumefaciens, přenáší segment T-DNA z plazmidu indukujícího kořeny (Ri) do genomu infikovaných rostlinných buněk.
• Po expresi genů pro kořenový lokus (rol) je biosyntéza auxinu a cytokininu modifikována způsobem, který podporuje rychlou proliferaci adventivních kořenů.
• Vlasové kořeny se objevují v místě poranění

Nepřímá transformace pomcí Agrobacterium

• Využívá Agrobacteriem zprostředkovaný přenos genů.
• Je nejrozšířenější technikou pro transformaci rostlin a generování transgenních rostlin.
• Využívá A. tumefaciens s vhodným binárním (superbinárním) vektorem.
• Je založena na původním Ti-plazmidu, z kterého byly odstraněny geny pro tvorbu fytohormonů a opinů.
• Mezi hraniční sekvence T-DNA byla vložena cizorodá DNA, kterou chceme integrovat do rostlin. genomu.
• Nevyžaduje se přítomnost specifické sekvence, jenom hraniční.
• Existují 2 typy transformačních vektorů – intermediální a binární vektory.
• Intermediární (kointegrativní) vektory - malé plazmidy s krátkými úseky, s levou a pravou hraniční sekvencí, tu se vkládá zájmový gen a gen selekční.
• Jsou schopny replikace jenom v E. coli, nikoliv v Agrobacterium.
• Do Agrobacterium je vnesen transformací nebo konjugací; udrží se v buňkách ve kterých došlo k rekombinaci mezi homologními sekvencemi Ti plazmidu a intermediálního vektoru.
• Principem konstrukce binárních vektorů je rozdělení velice rozsáhlého Ti plazmidu na dva plazmidy menší, úsek virulence a T-DNA nejsou společně přítomny na jednom plazmidu.
• Menší plazmid (klonovací) - obsahuje hraniční sekvence T-DNA, mezi ně se naklonuje DNA určená k přenosu a selekční gen.
• Větší plazmid (pomocný) - nese větší část Ti-plazmidu (obsahuje všechny geny potřebné pro infekci hostitele a přenos T-DNA).
• Superbinární vektory obsahují T-DNA a některé geny z vir oblasti a zvyšují účinnost transformace.
• Obecný transformační protokol: příprava Agrobacterium nesoucí co-integrovaný nebo binární vektor s zájmovým genem výběr vhodného explantátu - buňky, protoplasty, pletiva, orgány co-kultivace explantátů s Agrobacterium – minuty až dni eliminace Agrobacterium s vhodným antibiotikem bez poškození rostlinné tkáně selekce transformovaných rostlinných buněk regenerace celých rostlin nesoucích stabilně integrovaný transgén (ověření pomocí PCR, Southern blot)
• floral-dip - Clough a Bent (1998)

Výhody Agrobacterium

• Jedná se o přirozený způsob přenosu genů.
• Agrobacterium lze pohodlně infikovat jakýkoliv explantát (buňky/pletiva/orgány).
• Stabilita přenesené DNA je poměrně dobrá a transformované rostliny mohou být účinně regenerovány.
• Limitace Agrobacterium- zprostředkované transformace:
• Omezení hostitelských rostlin pro Agrobacterium, protože mnohé plodiny (jednoděložné - obiloviny) nejsou přirozeně infikování.
• Vyvinuty virulentní kmeny Agrobacterium, které mohou infikovat široké spektrum rostlin včetně obilovin.
• Buňky, které efektivněji regenerují jsou často obtížné pro transformaci, např. embryonální buňky leží v hlubokých vrstvách, které jsou těžko přístupné pro Agrobacterium.
• Agrobacteriem zprostředkovaná transformace jednodělož. rostlin - 10let po první úspěšné transformaci dvouděložných (D) (tabák, Barton1983 vs. rýže, Chan et. al.1993).
• Mikroprojektilova metoda – nejpoužívanější u jednoděložných rostlin (M), přímí transfer DNA do různých kompartmentů, buněčných typů a rostlinných druhů bez změny jejích regenerační schopnosti
• Anatomické rozdíly M/D – složení BS - D: glukany a xyloglukany, M: arabinoxylany a xylóza
• Nepřítomnost/nízká hladina fenolických exudátů – stimulátory/inhibitory
• Extrémně slabá odpověď na poranění: D – tumorovité pletivo, M – rychlá tvorba lignifikovaného/sklerenchymatického prstence – uzavření rány – nepřístupné pro Agrobacterium – jenom pár okrajových buněk kompetentních na regeneraci/transformaci
• Indukce vir genů
• Metylace – inaktivace transgenu – u M vyšší
• Regenerační schopnost

In Planta transformace

• floral-dip – Clough a Bent (1998).
• Poupata/květy rostliny jsou ponořeny do buněčné suspenze obsahující Agrobacterium, v přítomnosti povrchově aktivního činidla (Silwet L-77) pro zlepšení smáčivosti média.
• T-DNA se dostává do samičího gametofytu, přes vajíčko se transgen přenáší do další generace, T1 generace je heterozygotní.
• Semena vyprodukovaná z T1 rostlin se označují jako T2 generace a mohou být heterozygotní, homozygotní nebo nemusí transgén obsahovat.
• Rostliny mohou být suspenzí s Agrobacterium i stříkány (floral spray).
• Využití u velkých rostlinných druhů.
• Součástí vektorů jsou selekční geny, jenž se exprimují v rostlinných buňkách.
• Gen pro rezistenci ke kanamycinu, k hygromycinu nebo k herbicidu fosfinotrycinu.
• Někdy jsou součástí vektorů také reporterové geny: GUS (gen pro β – glukuronidázu), substráty zbarvuje modře, GFP, Luciferáza a antokyany.

Virové vektory

• Zájmový gen je vložen do genomu viru
• Virus obsahující požadovaný gen se musí replikovat v rostl. buňce a zájmový protein je produkován ve významném množství
• rostlinné virové vektory - efektivní alternativa pro přechodnou expresi heterologních proteinů.
• Výhody vir. vektorů: protein může být produkován mnohem rychleji a ve vysokém výtěžku; gen zaujmu není začleněn do rostlinného genomu; heterologní proteiny poskytují užitečný nástroj pro „large-scale“ produkci proteinů s farmaceutickým významem (protilátky a vakcíny).
• transfer genů pomocí virusů má vysokou eficienci, protože amplifikace přenášeného genu probíhá replikací virusového genomu
• virové vektory jsou DNA nebo RNA molekuly, přirozeně exprimující svou genetickou informaci v rostlinách.
• jedná se o neintegrativní vektory – na rozdíl od T-DNA u A. tumefaciens, které jsou integrativní vektory
• neintegrují se, ale rozšiřují se systematicky v rostlině a akumulují velký počet kopií v cílových buňkách.
• Existují 2 typy virových vektorů: vektory první generace – využívají celý virus – “full virus strategy“; vektory druhé generace.
• Vektory první generace - vhodné pro expresi dlouhých polypeptidů (~ 140 aminokyselin dlouhé), jako fúze k obalovému proteinu viru;
• Požadovaný protein je exprimován pod silným virovým promotorem
• Požadovaný gen se přenáší do rostlinných buněk za použití infekční kopie nukleové kyseliny vektoru nebo, přednostně, jako zralé virové částice ; postřik rostlin na poli se směsí virových částic s abrazívem
• v závislosti na účinnosti vektoru a jeho schopnost pohybovat se systémově - pro většinu tkání transfekovaných rostlin jsou nutné 2 až 3 týdny nakazit se.
• vývoj průmyslového procesu vyžaduje schopnost transfekci velkého počtu rostlin, s co největším počte listů/pletiv v rámci každé rostliny, ve skleníku nebo na poli a je však šíření viru asynchronní, infekce postupuje s různou rychlostí v jednotlivých listech
• vektory 2. generaci - dekostruované virusy ponechali virové sekvence důležité pro expresi; odstranění obalového proteinu a výměna systémové pohyblivosti umělým dodáním virového vektoru do celé rostliny za použití Agrobacterium; v závislosti na konkrétním genu – výtěžek až 5 g rekombinantního proteinu na kg čerstvých listů biomasy.
• Používá se modifikace magnifekce: např. virová infekce rostliny kombinovaná s použitím Agrobacteria nebo vakuová - ponoření