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Questions and Answers
Quantas variantes de transcritos (isoformas) existem para este gene?
Quantas variantes de transcritos (isoformas) existem para este gene?
14 isoformas no total (12 do gencode, 2 do NCBI).
As bases de dados GENCODE (Ensembl) e NCBI mostram as mesmas isoformas?
As bases de dados GENCODE (Ensembl) e NCBI mostram as mesmas isoformas?
Não, existem 13 isoformas diferentes, apenas uma é igual.
Quantos exões existem para este gene?
Quantos exões existem para este gene?
Há 3 exões principais comuns a todas as isoformas.
Qual exon contém o local de início da transcrição?
Qual exon contém o local de início da transcrição?
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Quais genes serão amplificados pelos priemers abaixo?
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Qual é o tamanho esperado do fragmento amplificado?
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Quais regiões do MYC serão amplificadas pelos primers?
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Quais são os diferentes tipos de alterações no número de cópias do gene CDKN2A?
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O que é a análise de sobrevivência em relação a doenças?
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Qual é a função principal dos genome browsers?
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O que é In-Silico PCR e como é utilizado?
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Quais são os objetivos de identificar alterações moleculares nas doenças?
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O que representam as caixas, linhas e setas em um genome browser?
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Como a análise de mutações pode afetar a sobrevivência do paciente?
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Qual a importância de se usar diferentes browsers para o estudo do genoma?
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Quais são as principais vantagens do PCR em tempo real?
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Por que o PCR em tempo real pode não ser eficiente quando se estuda muitos genes?
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Como as tecnologias de sequenciação em larga escala (HTS) melhoram a análise gênica?
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Qual é a função dos adaptadores universais nas técnicas de sequenciação?
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Como os microarrays contribuem para a quantificação de RNA?
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Qual é a relação entre a fluorescência e a quantidade de RNA na amostra durante a análise com microarrays?
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Em que se baseia o método de sequenciação semelhante à de Sanger mencionado no conteúdo?
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Quais são as desvantagens do PCR em tempo real para análise de múltiplos genes?
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Qual é o primeiro passo na preparação de uma biblioteca para RNA-seq e por que é realizado?
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Quais são algumas aplicações da técnica RNA-seq?
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Como a abordagem 'single-cell sequencing' difere do 'bulk sequencing'?
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O que é o GTExPortal e qual sua importância?
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Quais aspectos fenotípicos são considerados no GTExPortal?
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Por que é necessário preparar uma biblioteca diferente para miRNA-seq?
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Qual é a função dos picos na análise de RNA-seq?
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Quais informações são úteis para comparação de amostras em sequenciamento?
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O que os gráficos apresentados indicam sobre o tipo de alteração genética e suas cores?
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O que são hotspots no contexto das mutações genéticas?
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Como a boxplot pode indicar a expressão gênica em relação ao diploide?
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Quais fatores podem influenciar a expressão gênica em alterações estruturais?
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Por que a amplificação de um gene pode ter baixa expressão?
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Qual é o impacto das mutações na função de um gene?
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O que representa a altura das bolinhas nos gráficos de mutações?
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Quais tipos de alterações genéticas podem afetar a expressão genética de forma significativa?
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Quais são as implicações da duplicação gênica no músculo esquelético?
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Como o cBioPortal contribui para o estudo de alterações genéticas em doentes oncológicos?
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Quais tipos de dados são sequenciados pelos consórcios em biobancos de câncer?
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O que é medicina de precisão e como se aplica ao câncer?
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Quais são os passos envolvidos no sequenciamento de amostras tumorais?
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Qual a relevância de biomarcadores na classificação de biópsias?
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Como os genes-alvo podem ser usados em terapias personalizadas?
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O que significa heterogeneidade tumoral e qual a sua importância?
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Study Notes
Tecnologias de Sequenciação em Larga Escala (HTS)
- As técnicas de sequenciação mais recentes permitem medir todos os genes de uma amostra sem conhecimento prévio.
- A sequenciação de Sanger adiciona um nucleótido de cada vez, com fluorescência própria.
- A tecnologia Illumina permite a preparação de uma biblioteca a partir de uma amostra de RNA ou DNA, para amplificar a geração de clusters (com fluorescência) e sequenciar.
- A sequenciação por síntese com terminadores reversíveis resulta num ficheiro FASTQ com milhões de sequências a serem comparadas em bases de dados.
- O ficheiro FASTQ contém todas as sequências medidas, independentemente de serem iguais; a frequência de uma sequência representa a quantidade de mRNA expressa.
PCR em Tempo Real (PCR quantitativo)
- Combina a amplificação por PCR convencional com a deteção e medição do produto em cada ciclo, utilizando fluorescência.
- Principais Vantagens: quantificação precisa, sensibilidade elevada e especificidade.
- Principais Desvantagens: muita complexidade para medir poucos genes de cada vez.
Microarrays
- Baseia-se numa lâmina com várias sondas que funcionam como primers.
- Permite quantificar os genes predefinidos em diferentes amostras, mas depende das sondas apropriadas.
- Vantagem: método versátil para análise de diferentes amostras.
- Desvantagem: conhecimento prévio dos genes para criação de sondas.
Aplicação de HTS
- Whole-Genome Sequencing (WGS): sequenciação completa do genoma para estudo de mutações pontuais, indels e outras alterações.
- miRNA-seq: sequenciação de moléculas de RNA menores que 200 nucleótidos (muito pequeno); usada para análise de expressão gênica.
- RNA-seq: sequenciação de RNA para análise de expressão gênica, usando transcritoma>200nt.
- CHIP-seq: para determinar as regiões do genoma onde se ligam os fatores de transcrição (FTS).
Análise de dados
- Raw Data: dados brutos gerados por sequenciamento de alta capacidade.
- Alinhamento de leituras: para alinhar as leituras com o genoma de referência usando um algoritmo como Burrows-Wheeler Transform (BWT).
- Controlo de qualidade: identificando artefactos ou problemas do sequenciamento, como a qualidade das sequências, composição de nucleótidos, questões técnicas ou sequências super-representadas e sequências de adaptadores.
- Alinhamento/Assembly: alinhar os dados de acordo com o objetivo.
- Genome browsers, motores de consulta, são usados para visualizar e interpretar dados genómicos, alinhamentos de dados HTS.
- ficheiros FASTQ, formatação; informação sobre o genoma, software de alinhamento; metadados, sequencia leitura, pontuações qualitativas; um alinhamento por linha
Expressão Gênica
- BigWig: formato de cobertura de leituras.
- Sam e Bam: contêm o alinhamento das leituras;
- TPMs: transcritos por milhão de bases.
Técnicas de Normalização
- Métodos de normalização de dados RNA-Seq como CPM e TPM (transcritos por milhão) para ajustar a profundidade de sequenciação e o tamanho do gene
Considerações Adicionais
- Dados de RNA-Seq podem expressar fenótipos, mas devem ser analisados cuidadosamente devido a potencial erros técnicos.
- Níveis de RNA nem sempre são 100% correlacionados com a atividade de proteínas, e também são afetados por processos como transporte de RNA para fora do núcleo, splicing alternativo, etc.
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Description
Explore as mais recentes técnicas de sequenciação em larga escala e PCR em tempo real. Aprenda sobre a sequenciação de Sanger, tecnologia Illumina e como a PCR quantitativa permite a quantificação precisa de amostras genéticas. Este quiz é uma oportunidade para testar seu conhecimento sobre essas tecnologias inovadoras.