Tecnologias de Sequenciação e PCR Quantitativo
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Questions and Answers

Quantas variantes de transcritos (isoformas) existem para este gene?

14 isoformas no total (12 do gencode, 2 do NCBI).

As bases de dados GENCODE (Ensembl) e NCBI mostram as mesmas isoformas?

Não, existem 13 isoformas diferentes, apenas uma é igual.

Quantos exões existem para este gene?

Há 3 exões principais comuns a todas as isoformas.

Qual exon contém o local de início da transcrição?

<p>O 1º exon contém o local de início da transcrição.</p> Signup and view all the answers

Quais genes serão amplificados pelos priemers abaixo?

<p>O gene B2M.</p> Signup and view all the answers

Qual é o tamanho esperado do fragmento amplificado?

<p>86 pb.</p> Signup and view all the answers

Quais regiões do MYC serão amplificadas pelos primers?

<p>Não há amplificação do MYC neste caso.</p> Signup and view all the answers

Quais são os diferentes tipos de alterações no número de cópias do gene CDKN2A?

<p>Deep Deletion, Shallow Deletion, Diploid, Gain e Amplificação.</p> Signup and view all the answers

O que é a análise de sobrevivência em relação a doenças?

<p>É a medição do tempo até a morte do paciente ou eventos relacionados, como o reaparecimento do tumor.</p> Signup and view all the answers

Qual é a função principal dos genome browsers?

<p>Permitem explorar o genoma, como se fosse um Google Maps, disponibilizando informações sobre genes.</p> Signup and view all the answers

O que é In-Silico PCR e como é utilizado?

<p>É uma ferramenta que permite saber onde os primers hibridam no genoma.</p> Signup and view all the answers

Quais são os objetivos de identificar alterações moleculares nas doenças?

<p>Diagnóstico, prognóstico, terapêutica e monitoramento da doença.</p> Signup and view all the answers

O que representam as caixas, linhas e setas em um genome browser?

<p>Caixas representam exões, linhas representam intrões e setas indicam a direção do gene.</p> Signup and view all the answers

Como a análise de mutações pode afetar a sobrevivência do paciente?

<p>Determinadas mutações podem impactar negativamente ou positivamente na sobrevivência do paciente.</p> Signup and view all the answers

Qual a importância de se usar diferentes browsers para o estudo do genoma?

<p>Cada browser pode oferecer diferentes opções de visualização e informações sobre o genoma.</p> Signup and view all the answers

Quais são as principais vantagens do PCR em tempo real?

<p>As principais vantagens do PCR em tempo real são a quantificação precisa, alta sensibilidade e especificidade.</p> Signup and view all the answers

Por que o PCR em tempo real pode não ser eficiente quando se estuda muitos genes?

<p>O PCR em tempo real não é eficiente para muitos genes devido ao trabalho intensivo necessário para medir vários alvos ao mesmo tempo.</p> Signup and view all the answers

Como as tecnologias de sequenciação em larga escala (HTS) melhoram a análise gênica?

<p>As HTS permitem medir rapidamente a expressão de todos os genes de uma amostra sem conhecimento prévio sobre quais genes estudar.</p> Signup and view all the answers

Qual é a função dos adaptadores universais nas técnicas de sequenciação?

<p>Os adaptadores universais permitem que o RNA ou DNA fragmentados se prendam à lâmina durante a sequenciação, independentemente da sequência.</p> Signup and view all the answers

Como os microarrays contribuem para a quantificação de RNA?

<p>Os microarrays utilizam sondas específicas para hibridar com RNA de interesse, e a fluorescência é medida para determinar a quantidade de RNA presente.</p> Signup and view all the answers

Qual é a relação entre a fluorescência e a quantidade de RNA na amostra durante a análise com microarrays?

<p>Uma maior fluorescência indica uma maior quantidade de RNA hibridado com a sonda específica no microarray.</p> Signup and view all the answers

Em que se baseia o método de sequenciação semelhante à de Sanger mencionado no conteúdo?

<p>O método baseia-se na adição de nucleotídeos com fluorescência, um de cada vez, à amostra.</p> Signup and view all the answers

Quais são as desvantagens do PCR em tempo real para análise de múltiplos genes?

<p>As desvantagens incluem o trabalho intensivo necessário e a ineficiência ao medir muitos genes simultaneamente.</p> Signup and view all the answers

Qual é o primeiro passo na preparação de uma biblioteca para RNA-seq e por que é realizado?

<p>O primeiro passo é converter RNA em cDNA, pois isso proporciona maior estabilidade ao material genético.</p> Signup and view all the answers

Quais são algumas aplicações da técnica RNA-seq?

<p>Estudar o epigenoma, visualizar a localização da polimerase e analisar a expressão de um gene.</p> Signup and view all the answers

Como a abordagem 'single-cell sequencing' difere do 'bulk sequencing'?

<p>Na 'single-cell sequencing', isola-se o RNA de cada célula individualmente, enquanto no 'bulk sequencing' analisa-se uma média de várias células.</p> Signup and view all the answers

O que é o GTExPortal e qual sua importância?

<p>O GTExPortal é uma base de dados que contém informações sobre a expressão de genes em tecidos humanos saudáveis, segregadas por tipo de tecido.</p> Signup and view all the answers

Quais aspectos fenotípicos são considerados no GTExPortal?

<p>Sexo, idade e etnia são alguns dos traços fenotípicos considerados.</p> Signup and view all the answers

Por que é necessário preparar uma biblioteca diferente para miRNA-seq?

<p>Na miRNA-seq, a biblioteca é preparada especificamente com RNAs mais pequenos, que são os microRNAs.</p> Signup and view all the answers

Qual é a função dos picos na análise de RNA-seq?

<p>Os picos representam as zonas onde há maior concentração de reads, indicando alta expressão gênica.</p> Signup and view all the answers

Quais informações são úteis para comparação de amostras em sequenciamento?

<p>Os barcodes utilizados no 'single-cell sequencing' permitem a comparação entre amostras de diferentes células.</p> Signup and view all the answers

O que os gráficos apresentados indicam sobre o tipo de alteração genética e suas cores?

<p>As cores indicam diferentes tipos de alterações: verde para mutações, roxo para estrutural, vermelho para amplificação, azul para deleção e cinza para múltiplas alterações.</p> Signup and view all the answers

O que são hotspots no contexto das mutações genéticas?

<p>Hotspots são sítios com tendência a ter mais mutações e que podem ser significativas para o desenvolvimento do tumor.</p> Signup and view all the answers

Como a boxplot pode indicar a expressão gênica em relação ao diploide?

<p>Se a boxplot estiver abaixo da do diploide, indica menos expressão, enquanto acima sugere mais expressão.</p> Signup and view all the answers

Quais fatores podem influenciar a expressão gênica em alterações estruturais?

<p>A expressão gênica pode ser influenciada por alterações nos promotores e a presença de fatores regulatórios como RBP e TF.</p> Signup and view all the answers

Por que a amplificação de um gene pode ter baixa expressão?

<p>A amplificação pode incluir apenas os exões, sem os elementos regulatórios essenciais, resultando em baixa expressão.</p> Signup and view all the answers

Qual é o impacto das mutações na função de um gene?

<p>Nem todas as mutações resultam em mudanças na função do gene; algumas podem não alterar a formação da proteína funcional.</p> Signup and view all the answers

O que representa a altura das bolinhas nos gráficos de mutações?

<p>A altura das bolinhas representa quantos genes estão mutados, refletindo a frequência das mutações.</p> Signup and view all the answers

Quais tipos de alterações genéticas podem afetar a expressão genética de forma significativa?

<p>Alterações no número de cópias do gene, como deleções ou ampliações, podem ter um impacto significativo na expressão genética.</p> Signup and view all the answers

Quais são as implicações da duplicação gênica no músculo esquelético?

<p>As duplicações gênicas podem levar a especializações funcionais distintas entre os genes, resultando em funções mais particulares no músculo esquelético.</p> Signup and view all the answers

Como o cBioPortal contribui para o estudo de alterações genéticas em doentes oncológicos?

<p>O cBioPortal permite acessar dados sobre alterações genéticas em diferentes tipos de câncer, facilitando o estudo e a associação dessas alterações em pacientes.</p> Signup and view all the answers

Quais tipos de dados são sequenciados pelos consórcios em biobancos de câncer?

<p>Os consórcios sequenciam o genoma, transcritoma, microRNAs, metilação do DNA e proteínas.</p> Signup and view all the answers

O que é medicina de precisão e como se aplica ao câncer?

<p>Medicina de precisão refere-se ao uso de perfis moleculares para personalizar tratamentos, aplicando-se ao câncer por meio da caracterização dos tumores.</p> Signup and view all the answers

Quais são os passos envolvidos no sequenciamento de amostras tumorais?

<p>Os passos incluem a identificação de biomarcadores e a análise de genes-alvo para intervenções terapêuticas.</p> Signup and view all the answers

Qual a relevância de biomarcadores na classificação de biópsias?

<p>Os biomarcadores são fundamentais para classificar biópsias com base em características moleculares específicas, permitindo diagnósticos mais precisos.</p> Signup and view all the answers

Como os genes-alvo podem ser usados em terapias personalizadas?

<p>Genes-alvo podem servir como pontos de intervenção terapêutica, possibilitando tratamentos mais eficazes e personalizados.</p> Signup and view all the answers

O que significa heterogeneidade tumoral e qual a sua importância?

<p>Heterogeneidade tumoral refere-se à diversidade celular presente em um tumor, sendo importante para entender a resposta ao tratamento e a progressão da doença.</p> Signup and view all the answers

Study Notes

Tecnologias de Sequenciação em Larga Escala (HTS)

  • As técnicas de sequenciação mais recentes permitem medir todos os genes de uma amostra sem conhecimento prévio.
  • A sequenciação de Sanger adiciona um nucleótido de cada vez, com fluorescência própria.
  • A tecnologia Illumina permite a preparação de uma biblioteca a partir de uma amostra de RNA ou DNA, para amplificar a geração de clusters (com fluorescência) e sequenciar.
  • A sequenciação por síntese com terminadores reversíveis resulta num ficheiro FASTQ com milhões de sequências a serem comparadas em bases de dados.
  • O ficheiro FASTQ contém todas as sequências medidas, independentemente de serem iguais; a frequência de uma sequência representa a quantidade de mRNA expressa.

PCR em Tempo Real (PCR quantitativo)

  • Combina a amplificação por PCR convencional com a deteção e medição do produto em cada ciclo, utilizando fluorescência.
  • Principais Vantagens: quantificação precisa, sensibilidade elevada e especificidade.
  • Principais Desvantagens: muita complexidade para medir poucos genes de cada vez.

Microarrays

  • Baseia-se numa lâmina com várias sondas que funcionam como primers.
  • Permite quantificar os genes predefinidos em diferentes amostras, mas depende das sondas apropriadas.
  • Vantagem: método versátil para análise de diferentes amostras.
  • Desvantagem: conhecimento prévio dos genes para criação de sondas.

Aplicação de HTS

  • Whole-Genome Sequencing (WGS): sequenciação completa do genoma para estudo de mutações pontuais, indels e outras alterações.
  • miRNA-seq: sequenciação de moléculas de RNA menores que 200 nucleótidos (muito pequeno); usada para análise de expressão gênica.
  • RNA-seq: sequenciação de RNA para análise de expressão gênica, usando transcritoma>200nt.
  • CHIP-seq: para determinar as regiões do genoma onde se ligam os fatores de transcrição (FTS).

Análise de dados

  • Raw Data: dados brutos gerados por sequenciamento de alta capacidade.
  • Alinhamento de leituras: para alinhar as leituras com o genoma de referência usando um algoritmo como Burrows-Wheeler Transform (BWT).
  • Controlo de qualidade: identificando artefactos ou problemas do sequenciamento, como a qualidade das sequências, composição de nucleótidos, questões técnicas ou sequências super-representadas e sequências de adaptadores.
  • Alinhamento/Assembly: alinhar os dados de acordo com o objetivo.
  • Genome browsers, motores de consulta, são usados para visualizar e interpretar dados genómicos, alinhamentos de dados HTS.
  • ficheiros FASTQ, formatação; informação sobre o genoma, software de alinhamento; metadados, sequencia leitura, pontuações qualitativas; um alinhamento por linha

Expressão Gênica

  • BigWig: formato de cobertura de leituras.
  • Sam e Bam: contêm o alinhamento das leituras;
  • TPMs: transcritos por milhão de bases.

Técnicas de Normalização

  • Métodos de normalização de dados RNA-Seq como CPM e TPM (transcritos por milhão) para ajustar a profundidade de sequenciação e o tamanho do gene

Considerações Adicionais

  • Dados de RNA-Seq podem expressar fenótipos, mas devem ser analisados cuidadosamente devido a potencial erros técnicos.
  • Níveis de RNA nem sempre são 100% correlacionados com a atividade de proteínas, e também são afetados por processos como transporte de RNA para fora do núcleo, splicing alternativo, etc.

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