Tecniche Analitiche in Biochimica

Study Notes

DAR (Drug-to-Antibody Ratio): Rappresenta l'abbondanza relativa e viene analizzato mediante:
- Cromatografia a interazione idrofobica (HIC) e spettroscopia UV
- Cromatografia a esclusione dimensionale (SEC) accoppiata a spettrometria di massa (MS)
- SDS-PAGE seguita da analisi MS
Distribuzione del farmaco legato (DOP):
- È critica per l'efficacia del farmaco; il legame del payload può influenzare negativamente l'interazione con l'antigene.
- Un DOP eterogeneo porta a vari pattern di legame delle lisine, influenzando farmacocinetica e tossicologia.
Punto isoelettrico:
- La coniugazione del farmaco può alterare la carica dell'anticorpo, causando aggregazione.
- Modifiche come coniugazione, deaminazione e glicosilazione influiscono sulla stabilità.
- Tracciato mediante cromatografia a scambio ionico (IEX) o isoelettrofocusing (IEF).
Quantità di farmaco libero:
- Troppo farmaco libero comporta tossicità e instabilità del prodotto.
- Tecniche per la determinazione includono HPLC e CE, valutando solubilità e proprietà del payload.
Sequenza amminoacidica:
- Importante per garantire che le reazioni chimiche non alterino la struttura dell'anticorpo.
- Sequenziamento e mappatura delle modifiche sono essenziali.
Peso molecolare:
- Determinato con le stesse tecniche di DAR, cruciale per identificare aggregati.
- Analisi può essere top-down (proteina intatta) o middle-down (trattamento parziale).

Cromatografia:
- Utilizza eluizione isocratica (composizione fissa) o a gradiente (cambiamento composizione durante l'analisi).
- Gradiente ottimale riduce i tempi di analisi ma abbassa la risoluzione.
Cromatografia a esclusione molecolare:
- Non lavorata a gradiente per evitare interazioni con la fase stazionaria.
- Impiega solventi organici e sali per rompere interazioni indesiderate.
Metodi cromatografici 2D:
- Consente separazione sequenziale per picchi non risolti, frazionando il campione.

Propagazione delle onde:
- Onde si propagano nel vuoto con velocità costante; innalzano periodicamente energia, λ e frequenza.
- Intensità (energia totale per secondo su area) misurata in steradiante.
Orbitale molecolare:
- Comportamento elettronico in due o più atomi; presenta orbitali di legame e anti-legame.
Cromofori e auxocromi:
- Aggiunta a sostanze come benzene modifica ε, causando shift batocromico e ipercromico favorendo la delocalizzazione.
Legame peptidico:
- Assorbe tra 210-220nm; aa aromatici (Phe, Tyr, Trp) assorbono a 260-280nm per i loro sostituenti.
Tecniche di emissione:
- Misurano radiazione emessa dopo eccitazione; l'emissione avviene a λ maggiore e bassa energia rispetto all'assorbimento.
- Due monocromatori utilizzati per separare radiazione incidente e quella emessa.

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