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Questions and Answers
¿Cuál de las siguientes modificaciones en el protocolo estándar de Southern blot tendría el impacto más directo en la especificidad de la detección de una secuencia de ADN diana?
¿Cuál de las siguientes modificaciones en el protocolo estándar de Southern blot tendría el impacto más directo en la especificidad de la detección de una secuencia de ADN diana?
- Incrementar la temperatura de hibridación en 10°C por encima de la $T_m$ calculada de la sonda.
- Aumentar la concentración de sales en la solución de pre-hibridación para minimizar la unión no específica de la sonda. (correct)
- Utilizar una sonda de ADN con una longitud significativamente menor (ej., 15-20 nucleótidos).
- Emplear enzimas de restricción que generen fragmentos con extremos cohesivos en lugar de extremos romos.
En un experimento de Northern blot para analizar la expresión génica en respuesta a un tratamiento farmacológico, se observa una banda de ARN mensajero (ARNm) significativamente más tenue en las muestras tratadas en comparación con el control. ¿Cuál de los siguientes factores NO podría explicar esta observación?
En un experimento de Northern blot para analizar la expresión génica en respuesta a un tratamiento farmacológico, se observa una banda de ARN mensajero (ARNm) significativamente más tenue en las muestras tratadas en comparación con el control. ¿Cuál de los siguientes factores NO podría explicar esta observación?
- Incremento en la estabilidad del ARNm, resultando en una acumulación más lenta y, por ende, menor cantidad detectable en un tiempo dado. (correct)
- Degradación del ARNm debido a la activación de ARNasas inducida por el fármaco.
- Disminución en la tasa de transcripción del gen diana como resultado de la regulación a la baja por el fármaco.
- Un error en la transferencia del ARN desde el gel a la membrana, afectando selectivamente al ARNm de interés.
En un experimento de hibridación de colonias, ¿qué estrategia optimizaría la discriminación entre colonias que portan un plásmido con un inserto de una secuencia diana y aquellas que portan un plásmido sin el inserto, asumiendo que la sonda utilizada es complementaria a la secuencia del inserto?
En un experimento de hibridación de colonias, ¿qué estrategia optimizaría la discriminación entre colonias que portan un plásmido con un inserto de una secuencia diana y aquellas que portan un plásmido sin el inserto, asumiendo que la sonda utilizada es complementaria a la secuencia del inserto?
- Utilizar una sonda no marcada y detectar la hibridación mediante microscopía de contraste de fases.
- Incorporar un paso de lavado post-hibridación con una solución de alta astringencia (alta temperatura y baja concentración de sales). (correct)
- Reducir la temperatura de hibridación muy por debajo de la $T_m$ para promover la unión de la sonda a cualquier secuencia de ADN.
- Aumentar la concentración de ADN genómico total en el lisado celular para competir con la unión de la sonda al plásmido.
En un experimento de Dot blot, al analizar varias muestras con concentraciones variables de un oligonucleótido sintético, se observa que algunas muestras con concentraciones más altas muestran señales inesperadamente débiles. ¿Cuál de los siguientes fenómenos podría explicar este resultado paradójico?
En un experimento de Dot blot, al analizar varias muestras con concentraciones variables de un oligonucleótido sintético, se observa que algunas muestras con concentraciones más altas muestran señales inesperadamente débiles. ¿Cuál de los siguientes fenómenos podría explicar este resultado paradójico?
¿Cuál de las siguientes modificaciones al protocolo de hibridación en solución tendría el menor impacto en la cinética de hibridación, asumiendo condiciones de hibridación óptimas?
¿Cuál de las siguientes modificaciones al protocolo de hibridación en solución tendría el menor impacto en la cinética de hibridación, asumiendo condiciones de hibridación óptimas?
En un experimento de hibridación in situ (HIS) utilizando una sonda de ARNm, ¿cuál de las siguientes manipulaciones experimentales sería MENOS probable que cause una señal de fondo elevada y no específica?
En un experimento de hibridación in situ (HIS) utilizando una sonda de ARNm, ¿cuál de las siguientes manipulaciones experimentales sería MENOS probable que cause una señal de fondo elevada y no específica?
En un Western blot, se observa que la proteína de interés migra a una posición ligeramente superior a la esperada en el gel SDS-PAGE. ¿Cuál de las siguientes modificaciones postraduccionales podría explicar mejor esta discrepancia en el peso molecular aparente?
En un Western blot, se observa que la proteína de interés migra a una posición ligeramente superior a la esperada en el gel SDS-PAGE. ¿Cuál de las siguientes modificaciones postraduccionales podría explicar mejor esta discrepancia en el peso molecular aparente?
Durante la optimización de una PCR estándar, se encuentra que la amplificación del ADN diana es inconsistente y produce múltiples bandas inespecíficas. ¿Cuál de los siguientes ajustes tendría la menor probabilidad de mejorar la especificidad y eficiencia de la PCR?
Durante la optimización de una PCR estándar, se encuentra que la amplificación del ADN diana es inconsistente y produce múltiples bandas inespecíficas. ¿Cuál de los siguientes ajustes tendría la menor probabilidad de mejorar la especificidad y eficiencia de la PCR?
En un experimento de qPCR en tiempo real utilizando SYBR Green, se observa que la curva de disociación (melting curve) muestra múltiples picos en lugar de un único pico agudo. ¿Qué ajuste experimental sería MENOS efectivo para resolver este problema?
En un experimento de qPCR en tiempo real utilizando SYBR Green, se observa que la curva de disociación (melting curve) muestra múltiples picos en lugar de un único pico agudo. ¿Qué ajuste experimental sería MENOS efectivo para resolver este problema?
En una reacción de TaqMan PCR, se observa una señal de fluorescencia significativamente menor a la esperada para una muestra con alta concentración conocida del ADN diana. Asumiendo que la eficiencia de la PCR es óptima, ¿cuál de las siguientes hipótesis es la MENOS probable para explicar este resultado?
En una reacción de TaqMan PCR, se observa una señal de fluorescencia significativamente menor a la esperada para una muestra con alta concentración conocida del ADN diana. Asumiendo que la eficiencia de la PCR es óptima, ¿cuál de las siguientes hipótesis es la MENOS probable para explicar este resultado?
¿Cuál de las siguientes adaptaciones en el protocolo de RT-PCR sería MENOS adecuada para minimizar la amplificación de ADN genómico contaminante en una muestra de ARN?
¿Cuál de las siguientes adaptaciones en el protocolo de RT-PCR sería MENOS adecuada para minimizar la amplificación de ADN genómico contaminante en una muestra de ARN?
En un experimento de RT-qPCR, se detecta una marcada diferencia en la expresión génica entre dos grupos de muestras, pero al normalizar los datos con un gen de referencia (housekeeping gene) tradicional, la diferencia desaparece. ¿Cuál de las siguientes razones sería la MENOS probable para explicar este fenómeno?
En un experimento de RT-qPCR, se detecta una marcada diferencia en la expresión génica entre dos grupos de muestras, pero al normalizar los datos con un gen de referencia (housekeeping gene) tradicional, la diferencia desaparece. ¿Cuál de las siguientes razones sería la MENOS probable para explicar este fenómeno?
En un experimento de Western blot, la proteína de interés presenta una modificación postraduccional que induce un cambio significativo en su conformación tridimensional, pero no altera su peso molecular. ¿Qué estrategia sería la MENOS adecuada para mejorar la detección de esta proteína en el Western blot?
En un experimento de Western blot, la proteína de interés presenta una modificación postraduccional que induce un cambio significativo en su conformación tridimensional, pero no altera su peso molecular. ¿Qué estrategia sería la MENOS adecuada para mejorar la detección de esta proteína en el Western blot?
En un experimento de hibridación in situ fluorescente (FISH) para detectar un reordenamiento cromosómico, se observa una señal de fondo elevada y difusa que dificulta la identificación de las señales específicas. ¿Qué ajuste experimental sería el MENOS efectivo para reducir esta señal de fondo no específica?
En un experimento de hibridación in situ fluorescente (FISH) para detectar un reordenamiento cromosómico, se observa una señal de fondo elevada y difusa que dificulta la identificación de las señales específicas. ¿Qué ajuste experimental sería el MENOS efectivo para reducir esta señal de fondo no específica?
En un experimento de PCR cuantitativa multiplex con sondas TaqMan para la detección simultánea de múltiples genes, se observa que la eficiencia de amplificación de uno de los genes se ve significativamente inhibida en presencia de los otros. ¿Cuál de las siguientes estrategias sería MENOS probable que resuelva este problema de inhibición competitiva?
En un experimento de PCR cuantitativa multiplex con sondas TaqMan para la detección simultánea de múltiples genes, se observa que la eficiencia de amplificación de uno de los genes se ve significativamente inhibida en presencia de los otros. ¿Cuál de las siguientes estrategias sería MENOS probable que resuelva este problema de inhibición competitiva?
Flashcards
Southern blot
Southern blot
Detecta y cuantifica ADN en una muestra usando enzimas de restricción, electroforesis y una sonda de ADN marcada.
Northern blot
Northern blot
Detecta y cuantifica ARN en una muestra, similar al Southern blot pero para ARN.
Colony hybridization
Colony hybridization
Detecta bacterias o células que contienen una secuencia de ADN específica cultivándolas y usando una sonda marcada.
Dot-blot
Dot-blot
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Hibridación en solución
Hibridación en solución
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Hibridación in situ (HIS/FISH)
Hibridación in situ (HIS/FISH)
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Western blot
Western blot
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PCR estándar
PCR estándar
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PCR en tiempo real (qPCR)
PCR en tiempo real (qPCR)
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TaqMan PCR
TaqMan PCR
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RT-PCR
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Study Notes
- La ingeniería genética utiliza diversas técnicas para analizar y manipular el material genético.
Southern blot
- Se utiliza para detectar y cuantificar ADN en una muestra.
- El ADN se corta en fragmentos mediante enzimas de restricción.
- Los fragmentos se separan por tamaño mediante electroforesis en gel.
- Se añade una sonda de ADN marcada complementaria a la secuencia de interés.
- La sonda se une a la secuencia si está presente (hibridación) y se detecta mediante autorradiografía.
Northern blot
- Similar al Southern blot, pero detecta y cuantifica ARN en una muestra.
- El ARN se separa en un gel mediante electroforesis y se transfiere a una membrana.
- Se hibrida con una sonda de ADN o ARN complementaria marcada.
- Si el ARN de interés está presente, la sonda se une y se detecta.
Colony hybridization
- Se usa para detectar bacterias o células que contienen una secuencia de ADN específica.
- Las bacterias se cultivan en placas formando colonias, que luego se lisan para liberar su ADN.
- Se usa una sonda marcada que reconoce la secuencia de interés.
- Si una colonia tiene el ADN buscado, la sonda se une y se detecta.
Dot-blot
- Técnica sencilla que no requiere electroforesis.
- Una muestra de ADN o ARN se deposita directamente en una membrana en forma de puntos.
- La membrana se incuba con una sonda marcada para detectar la secuencia de interés.
- Se observa una señal en la membrana si la secuencia está presente.
Hibridación en solución
- La hibridación ocurre en un medio líquido, a diferencia de las técnicas que inmovilizan el ADN/ARN en una membrana.
- Se mezcla una sonda marcada con la muestra en una solución líquida.
- La sonda se une a la secuencia de interés si está presente.
- Se usa una técnica para detectar esta unión.
Hibridación in situ (HIS o FISH)
- Detecta ADN o ARN en células o tejidos enteros, sin extracción ni separación en geles.
- Las células o tejidos se fijan en un portaobjetos de microscopio.
- Se añade una sonda marcada que reconoce la secuencia de interés.
- Se visualizan los resultados con un microscopio de fluorescencia si la secuencia está presente y la sonda se ha unido.
Western blot
- Detecta proteínas específicas en una muestra biológica.
- Las proteínas se extraen y separan por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
- Se transfieren a una membrana y se detectan con anticuerpos.
- Se usa un anticuerpo primario que reconoce la proteína específica y luego un anticuerpo secundario para detectar la señal.
PCR estándar (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
- Amplifica ADN, generando muchas copias de un fragmento específico.
- Desnaturalización: separa las dos cadenas de ADN.
- Alineamiento (hibridación): los cebadores (primers) se unen a secuencias específicas del ADN a baja temperatura.
- Extensión: la enzima Taq polimerasa copia el ADN usando los cebadores como guía a alta temperatura.
- El ciclo se repite para generar millones de copias del fragmento de ADN.
PCR en tiempo real (qPCR o Real-Time PCR)
- Cuantifica el ADN en tiempo real durante la amplificación.
- Utiliza marcadores fluorescentes que emiten señal con cada copia nueva de ADN.
- La intensidad de la fluorescencia aumenta con cada ciclo y se mide en tiempo real con un equipo especializado.
Tipos de qPCR
- SYBR Green qPCR
- TaqMan qPCR
TaqMan PCR
- Variante de la PCR en tiempo real que usa una sonda TaqMan para mejorar la precisión de la detección.
- Una sonda específica con un fluoróforo en un extremo y un "apagador" en el otro es utilizada.
- El apagador evita la detección de la fluorescencia mientras la sonda está intacta.
- Durante la amplificación, la Taq polimerasa rompe la sonda, liberando el fluoróforo y permitiendo la detección de la señal.
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
- Combina transcripción inversa con PCR para amplificar ARN.
- Transcripción inversa: el ARN se convierte en ADN complementario (ADNc) usando la enzima transcriptasa inversa.
- El ADNc se amplifica con PCR normal o qPCR.
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