Techniques de base en biologie cellulaire

• L'observation des cellules est complexe en raison de leur taille minuscule, nécessitant des techniques spécifiques pour les visualiser.
• Ces techniques permettent l'observation de l'organisation morphologique des cellules et l'étude des structures cellulaires, qu'elles soient vivantes ou mortes

La Microscopie

• L'examen cellulaire nécessite l'utilisation de microscopes
• Il existe deux types de microscopes basés sur leur résolution: les microscopes optiques et les microscopes électroniques
• Les microscopes optiques utilisent un faisceau lumineux.
• Les microscopes électroniques utilisent un faisceau d'électrons.
• Quelle que soit la méthode de microscopie, la préparation des structures à étudier est essentielle.

Préparation des Coupes Fines (Étapes)

• La préparation des coupes fines comprend plusieurs étapes essentielles
• Fixation: consiste à immerger le tissu dans un fixateur qui tue les cellules tout en préservant leur immobilisation et leur conservation.
• Exemples de fixateurs: formaldéhyde, glutaraldéhyde, tétroxyde d'osmium.
• Déshydratation: élimination de l'eau par des bains d'alcool successifs.
• Inclusion: l'échantillon est inclus dans un matériau comme la résine ou la paraffine pour la solidification.
• Formation des coupes ultrafines: réalisée par des microtomes.
• Coloration: permet de renforcer le contraste des cellules et de leurs constituants grâce à différents colorants naturels ou synthétiques. Montage: les coupes sont étalées et collées sur une lame de verre.

Microscope Optique

• Les microscopes optiques, qu'ils soient à lumière transmise ou photoniques, permettent d'examiner des cellules vivantes ou mortes avec des coupes fines fixées.
• L'échantillon est éclairé en lumière transmise et observé à travers un système optique comprenant :
  • Un objectif: agrandit l'image de la structure étudiée
  • Un oculaire: permet l'examen de l'image
• Les cellules éclairées apparaissent très claires, nécessitant souvent une coloration pour faciliter l'observation.
• Le pouvoir séparateur est la capacité à distinguer deux points très proches comme deux points distincts.
• L'image de l'échantillon peut être agrandie jusqu'à 1000 fois, avec un pouvoir séparateur de 1/10 de micromètre.

Microscope à Fluorescence

• Un microscope optique avec deux filtres pour échantillon coloré par des fluorochromes.
• Le premier filtre ne laisse passer que la lumière qui excite le fluorochrome
• Le deuxième filtre ne laisse passer que la lumière émise par le fluorochrome
• Les fluorochromes absorbent une lumière spécifique et émettent une lumière différente.
• Exemples: Fluorescéine et Rhodamine.
• Les structures apparaissent très colorées sur un fond noir.
• Permet de détecter :
  • Les substances spontanément fluorescentes comme la vitamine A
  • Les structures qui fixent des colorants
• Permet de voir des macromolécules invisibles au microscope optique simple.
• Intérêts:
• Mise en évidence de la fluidité des protéines membranaires
• Détection, localisation, quantification des protéines cellulaires (hormones, protéines du cytosquelette)

Microscope à Contraste de Phase

• Se base sur le fait que l'onde lumineuse traversant les structures subit un retard et un changement de phase.
• Utilise les propriétés de réfraction de l'échantillon.
• Permet d'observer des structures vivantes, non fixées et non colorées, qui seraient peu ou pas visibles sans coloration.
• Les structures observées apparaissent en relief, permettant de visualiser les mitochondries, le noyau et d'autres structures cellulaires.

Microscope Électronique

• Permet l'étude d'objets très petits à l'intérieur de la cellule, jusqu'à l'échelle d'une macromolécule.
• Nécessite une préparation spéciale des cellules, différente de celle utilisée en microscopie optique.
• Utilise des lentilles électrostatiques et électromagnétiques pour former l'image en contrôlant et en convergeant le faisceau d'électrons.
• Produit des photos en noir et blanc.

Microscope Électronique à Transmission (MET)

• Utilise un rayonnement électronique.
• Possède un pouvoir séparateur 40 000 fois supérieur à celui du microscope optique, soit deux millions de fois plus que l'œil humain (théoriquement 2nm).
• Nécessite la déshydratation de l'échantillon, entraînant la mort des cellules.
• Les échantillons doivent être sous forme de coupes ultra fines (< 0.1µm) après inclusion dans une résine, en raison du faible pouvoir de pénétration des électrons.
• L'objet fixé est bombardé d'électrons, permettant d'obtenir une image agrandie sur un écran fluorescent.

Technique de Coloration Négative

• Permet de visualiser les structures qui échappent à la microscopie électronique.
• L'échantillon biologique est placé sur un film, et des sels de métaux lourds se déposent autour, piégés dans une pellicule de colorant imperméable aux électrons.
• L'échantillon apparaît en clair sur un fond sombre.

Microscope Électronique à Balayage (MEB)

• Balaye un échantillon avec un faisceau d'électrons après avoir recouvert la surface d'une fine couche de métal.
• Possède un pouvoir de résolution de 7nm.
• Fournit des images tridimensionnelles de l'échantillon (en relief).
• Utilisé pour étudier les surfaces cellulaires (contours), les organites et même l'intérieur des membranes.
• L'ombrage métallique, qui consiste à vaporiser sous vide une fine couche de métal lourd sur l'échantillon, permet d'accentuer les reliefs.

Méthodes de Fractionnement Subcellulaire

• Sépare les composants cellulaires en détruisant la membrane plasmique et en désorganisant la cellule.
• L'homogénéisation fait éclater la cellule en homogénéisant la cellule.
• Cela forme un homogénat avec tous les constituants cellulaires intacts, mais l'appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique se fragmentent en microsomes si aucune précaution n'est prise.

Centrifugation

• Permet de séparer les organites en fonction de leur coefficient de sédimentation, mesuré en unités Svedberg (S).
• La vitesse de sédimentation dépend de la taille et de la forme des particules.

Ultracentrifugation Différentielle

• Purifie l'homogénat en fonction de la taille et de la densité de ses constituants.
• Implique une série d'ultracentrifugations à vitesses croissantes qui séparent les composants selon leur vitesse de sédimentation.
• L'homogénat est centrifugé, et à chaque vitesse, différents organites se déposent dans le culot, qui est prélevé:
• À 600g, après 10 minutes, le noyau et le cytosquelette sédimentent.
• À 15 000g, après 5 minutes, les mitochondries, lysosomes et peroxysomes sédimentent.
• À 100 000g (ultracentrifugation), après 60 minutes, la membrane plasmique, les microsomes et les grands polysomes sédimentent.
• À 300 000g, après 2 heures, les ribosomes et les petits polysomes sédimentent, laissant la fraction hydrosoluble du cytosol.

Centrifugation par Gradient Préformé

• Dépose une fine couche d'homogénat sur une solution de saccharose dont la concentration diminue de façon régulière et décroissante.
• Les constituants de l'homogénat sédimentent à différentes vitesses, formant des bandes distinctes qui peuvent être séparées (la couche la plus dense étant au fond).
• La vitesse de sédimentation dépend de la taille, la forme et la densité des molécules, et est définie par le coefficient de sédimentation mesuré en unités Svedberg (S).

Ce quiz explore les principes de la microscopie électronique et du fractionnement subcellulaire. Il aborde des notions comme l'ombrage métallique, la sédimentation des organites et le rôle de l'objectif en microscopie optique. Testez vos connaissances sur ces techniques essentielles !