Structura Generală a Enzimelor

Structura Generală a Enzimelor

• Toate enzimele sunt proteine.
• Enzimele se clasifică structural în două tipuri principale: monocomponente (holoproteine) și bicomponente (heteroproteine).
• Enzimele monocomponente sunt alcătuite dintr-una sau mai multe catene polipeptidice.
• Enzimele bicomponente conțin o apoenzimă (partea proteică) și un cofactor enzimatic.
• Cofactorul se leagă de apoproteina prin legături covalente puternice, formând o grupare prostetică, sau prin legături necovalente slabe, formând o coenzimă.

Apoenzima

• Prezintă toate caracteristicile structurale ale proteinelor.
• Conține toți aminoacizii proteinogeni, și rareori alți aminoacizi, cum ar fi acidul gama-carboxi-glutamic găsit în protrombină.
• Aminoacizii din structura enzimelor sunt alfa-aminoacizi și izomeri L.
• Structura generală a unui alfa-aminoacid include un carbon alfa, o grupare amino (-NH2), o grupare carboxil (-COOH) și un radical (alifatic sau aromatic).
• Aminoacizii au structură asimetrică, prezentând chiralitate, cu excepția glicinei, care este simetrică.
• Între aminoacizi se formează legături peptidice.
• Legătura peptidică are caracter de dublă legătură parțială.
• Atomii legăturii peptidice sunt coplanari, în forma trans.
• Rotația liberă este permisă doar la nivelul celorlalte legături covalente.

Organizarea Structurală a Apoenzimelor

• Apoenzimele prezintă aceeași organizare structurală ca și proteinele: primară, secundară, terțiară și cuaternară.
• Structura primară este determinată de numărul, natura și succesiunea aminoacizilor.
• Resturile de aminoacizi sunt unite prin legături peptidice, unde distanța C-N este mai mică decât distanța C=O.

Structura Secundară a Apoenzimelor

• Apare datorită legăturilor de hidrogen între componentele legăturilor peptidice.
• Legăturile de hidrogen între resturile de aminoacizi de pe aceeași catenă polipeptidică formează structura alfa-helix.
• Legăturile de hidrogen între resturile de aminoacizi de pe catene diferite polipeptidice formează structura beta-pliată.
• Structura alfa-helix poate fi de dreapta sau de stânga.
• Prolina, hidroxiprolina și glicocolul pot perturba structura regulată alfa-helix.
• Structura beta-pliată poate avea catene paralele sau antiparalele.
• Structurile secundare sunt stabilizate prin legături de hidrogen.
• În structura alfa-helix, legăturile de hidrogen sunt intracatenare, iar catenele laterale ale aminoacizilor ies în afară și pot interacționa cu solventul.
• În structura beta-pliată, legăturile de hidrogen sunt intercatenare și perpendiculare pe axul moleculei, iar radicalii laterali sunt orientați de o parte și de alta a planului legăturii peptidice.
• Majoritatea enzimelor au structuri alfa-helix alternante cu beta-pliate.
• Structurile secundare ale enzimelor pot fi alfa-alfa, beta-beta, alfa-beta-alfa, beta-alfa-beta etc.

Structura Terțiară a Apoenzimelor

• Rezultă din interacțiunile dintre resturile de aminoacizi din catenele polipeptidice.
• Se formează prin supraspiralizarea catenelor polipeptidice care conțin fragmente alfa-helix și beta-pliate într-o structură spațială globulară.
• Menținerea și stabilizarea structurii tertiare se realizează prin forțe de atracție între radicalii aminoacizilor:
  • Legături de hidrogen între grupările fenol ale tirozinei și grupările -COOH ale acidului aspartic și glutamic, sau între nucleul imidazolic al histidinei și gruparea -OH a serinei.
  • Legături ionice între -COOH din acizii aspartic și glutamic și -NH2 din lizina și arginina.
  • Legături van der Waals între resturile hidrocarbonate din alanina, fenilalanina, leucina, valina și izoleucina.
• Radicalii nepolari sunt orientați spre interiorul moleculei (hidrofobi).
• Radicalii polari, ionizați, sunt orientați spre exterior și interacționează cu dipolii apei (hidrofili).
• Toate aceste interacțiuni asigură stabilitatea structurii tridimensionale și conformația optimă termodinamic.
• Diversitatea acestor legături și valorile energiilor determină labilitatea proteinelor sub acțiunea pH-ului mediului, temperaturii, presiunii osmotice și prezenței sau absenței unor substanțe chimice.
• Dezorganizarea structurii tertiare duce la pierderea proprietăților biologice ale proteinelor.
• Efectul alosteric este modificarea structurii tertiare prin legarea unui compus chimic cu masă moleculară mică.
• Structura terțiară are rol în reglarea activității enzimelor.
• Majoritatea apoenzimelor au forme terțiare intermediare, dependente de factorii de mediu, fiind fie fibrilare, fie globulare.

Structura Cuaternară a Apoenzimelor

• Nivelul cel mai înalt de organizare structurală, întâlnit doar la unele enzime.
• Implică asocierea a două sau mai multe catene polipeptidice într-o arhitectură spațială complexă.
• Subunitățile componente pot fi separate prin metode blânde, fără ruperea legăturilor covalente.
• Stabilizarea structurii cuaternare se realizează prin interacțiuni între subunități, bazate pe grupările funcționale libere ionizate, gruparile hidrofobe și gruparile sulfhidrice.
• Tinde spre un nivel minim de energie liberă și o stabilitate maximă, formând un număr mare de legături atât în interiorul moleculei, cât și cu moleculele solventului.

Particularități ale Apoenzimelor

• Enzimele pot avea activitate catalitică doar în forma oligomeră sau, în unele cazuri, și la nivelul subunităților.
• Subunitățile pot fi identice sau diferite.
• Masa moleculară a enzimelor variază între 10.000 și milioane de daltoni.
• Apoenzimele prezintă toate proprietățile fizico-chimice ale proteinelor.

Centrul Activ al Enzimelor

• Masa moleculară a enzimelor este mult mai mare decât cea a substratului, care reprezintă doar aproximativ 1%.
• Majoritatea enzimelor sunt heteroproteine, iar cofactorul catalitic este implicat în actul catalitic.
• Activitatea catalitică se realizează într-o regiune specifică a enzimei, numită centru activ sau situs catalitic.
• Structura situsului catalitic diferă de la o enzimă la alta și depinde de structura macromoleculei în ansamblu.

Situsul Catalitic

• La enzimele monocomponente, situsul catalitic este format din resturi de aminoacizi localizate în zone diferite ale catenelor polipeptidice, care devin vecine prin spiralare și pliere, grupate într-o arie de cel mult 30Å diametru.
• La enzimele bicomponente, cofactorul enzimatic face parte integrantă din structura situsului catalitic, singur sau împreună cu resturi de aminoacizi din structura apoenzimei.
• Situsul catalitic participă direct la actul catalitic.
• Toate segmentele structurale ale macromoleculei enzimatice participă, direct sau indirect, la realizarea transformărilor biochimice catalizate.
• Resturile de aminoacizi care alcătuiesc catenele polipeptidice ale apoenzimelor se clasifică în:
  • Grupări de contact (implicate în fixarea substratului și cataliză).
  • Grupări conformaționale (asigură conformația spațială necesară).
  • Grupări auxiliare (au proprietăți fizico-chimice; participă indirect).
  • Grupări indiferente (nu participă; pot fi clivate/înlocuite; facilitatoare).

Mecanismele de Legare în Situsul Catalitic

• Cinetica reacțiilor enzimatice este descrisă de modelul Michaelis-Menten: S + E ⇆ ES → P + E, unde ES este complexul Michaelis instabil.
• Între enzima (E) și substrat (S) pot apărea următoarele tipuri de legături:
  • Legături coordinative (cele mai puternice, la metaloenzime, unde se pun în comun electronii neparticipanți ai atomilor de O și N).
  • Legături de hidrogen (între atomii de H și de O sau N).
  • Atracții electrostatice (datorită grupărilor funcționale libere ce ionizează – grupări aminice libere din lizina și arginina, sau gruparile carboxil din acizii aspartic și glutamic).
  • Interacțiuni hidrofobe (la resturile de aminoacizi cu catenă lungă alifatică sau aromatică).
  • Transfer de sarcină (când substratul și enzima au structuri bogate, respectiv sărace în electroni).

Enzimele Alosterice

• Fenomenul de modificare a conformației unei enzime ca urmare a interacțiunii sale cu o anumită substanță, care se leagă într-o zonă diferită de situsul activ.
• De exemplu, 2,3-difosfogliceratul acționează asupra hemoglobinei într-o zonă diferită de centrii de transport pentru oxigen, interacționând cu atomii de N de la capetele N-terminale ale catenelor.
• Aceste modificări se realizează printr-o succesiune de reacții = cale/secvență metabolică.
• Inhibarea activității E1 are loc dacă produsul final (P) se acumulează în cantitate > fiziologic, acesta interacționând cu o zonă distinctă de situsul catalitic, numită centru alosteric.
• Acest tip de inhibiție se numește retroinhibiție/inhibiție de tip feed-back.
• Pe măsură ce P scade, ca urmare a transformării sale pe alte căi metabolice, E1 este dezinhibată, iar secvența se reia.
• Enzimele dintr-o secvență metabolică, în special prima enzimă, inhibate prin feed-back, se numesc enzime alosterice.

Proprietățile Enzimelor Alosterice

• Prezintă structură cuaternară.
• Nu respectă cinetica Michaelis-Menten (sunt enzime nemichaeliene).
• Pot suferi modificări conformaționale fără pierderea activității catalitice, fiind detectabile prin măsurători fizice sau cinetice.
• Au rol de reglare a metabolismului, în special în căile de biosinteză.
• Aspartat-transcarbamilaza din E. coli (EC 2.1.3.2) este un exemplu bine studiat de enzimă alosterică, care catalizează prima reacție dintr-o cale metabolică de biosinteză a nucleotidelor pirimidinice.
• Introducerea de CTP blochează activitatea enzimei, acționând ca un modulator negativ.
• Introducerea de AMP sau ATP determină activarea enzimei, acționând ca un modulator pozitiv.
• Tratarea enzimei cu p-clormercuribenzoat duce la reactivarea ei și redevine michaeliană, fiind desensibilizată și nemodată de CTP sau ATP.
• Structural, aspartat-transcarbamilaza este formată din 6 subunități catalitice și 6 subunități reglatoare (C6R6).
• Catenele catalitice C conțin două domenii: unul ecuatorial (recunoaște aspartatul) și unul polar (leagă radicalul fosfat).
• Catenele R interacționează cu subunitățile catalitice și au domenii de recunoaștere a nucleotidelor.
• Formele conformationale includ forma T (mai puțin activă) și forma R (forma activă).

Domenii Structurale

• Majoritatea proteinelor oligomere au capacitatea de a îndeplini mai multe funcții biologice/de a interacționa cu mai mulți compuși.
• Au structură modulară, din mai multe fragmente distincte unite între ele (structură cuaternară).
• Un domeniu este un fragment al unei molecule proteice ce posedă o conformație spațială relativ independentă.
• O proteină este o asociere de mai multe domenii unite prin fragmente flexibile.
• Un modul este un singur segment al secvenței de aminoacizi utilizat repetat în alcătuirea unui lanț polipeptidic.
• Majoritatea dehidrogenazelor au cel puțin două tipuri de domenii principale: unul format din fragmentele A1 și A2, și un domeniu specific fiecărei enzime în parte.
• Domeniul de legare a NAD+ este alcătuit din două nucleotide legate între ele prin intermediul radicalilor fosfat.
• Plierile Rossman sunt ansambluri formate din două straturi paralele separate de un fragment alfa-helix și sunt caracteristice proteinelor capabile să lege diferite nucleotide, localizate spre capetele N-terminale ale catenelor polipeptidice.

Enzime Membranare

• După localizarea lor intracelulară, enzimele se clasifică în enzime solubile (în citoplasmă, nucleoplasmă, matrice mitocondrială) și enzime membranare (înglobate în diferite membrane biologice, insolubile).
• Proteinele membranare se clasifică în:
  • Proteine intrinseci: asociate cu lipidele, intră în constituția membranei, nu pot fi extrase prin dizolvare în apă sau soluții tampon.
  • Proteine extrinseci/periferice: localizate la nivelul uneia dintre suprafețele membranare, ușor de extras la pH acid/bazic sau cu soluții tampon de tărie ionică superioară.
  • Proteine care se leagă de componentele membranare prin intermediul unei molecule lipidice ca ligand; sunt asemănătoare proteinelor solubile.

Caracteristici ale Enzimelor Membranare

• În membranele mielinice, lipidele depășesc 80%.
• În restul celulelor, proteinele reprezintă peste 50%.
• În membrana internă mitocondrială și în membranele lizosomale, proteinele depășesc 75%.
• Datorită caracterului lor parțial bipolar, apa străbate membranele biologice prin difuzie.
• Viteza de difuzie a apei este diferită, fiind foarte scăzută în țesuturile ale căror celule conțin proteine speciale numite acvaporine, care reglează tranzitul la nivelul porilor (epiteliu renal, eritrocite, stomate, celule radiculare).
• Majoritatea metabolitilor realizează un transport activ (transportul metabolitului printr-o membrană contra gradientului concentrației sale, cu consum de energie).
• Transportul transmembranar este facilitat de proteine speciale numite transportori (enzime și proteine enzim-like), care scad bariera energetică.
• Transportorii moleculelor polare și ai ionilor protejează porii hidrofili prin care se face transportul.

Tipuri de Enzime Membranare

• Porine: transportori care realizează transportul activ transmembranar.
• Permeaze: porine implicate în transportul activ al glucidelor.
• Citocromi: enzime implicate în transportul electronilor în procesul respirației (la nivel mitocondrial) și în fotosinteză (la nivelul tilacoidelor din cloroplaste).
• Citocomul b5 este localizat în reticulul endoplasmatic și participă la sistemul de transport al electronilor ce determină desaturarea acizilor grași; este o proteină membranară intrinsecă fixată de membrană printr-o secvență hidrofobă.
• Citocromul b5 primește un electron sub acțiunea unei reductaze specifice, care este tot o enzimă membranară.
• Citocromul b5 și reductaza nu sunt asociate permanent cu membrana reticulului endoplasmatic, ci clivează lateral în membrană; transferul de electroni se face în momentul întâlnirii celor două enzime în timpul difuziei.
• Activitatea catalitică a citocromului b5 și a reductazei este dată de fragmentele hidrofobe.