Spectroscopie de Fluorescence

• Spectroscopie de Fluorescence

Introduction

• La matière peut émettre de la lumière par divers mécanismes.
• L'incandescence est la lumière émise par les corps à haute température (lumière chaude).
• La luminescence est la lumière qui n'est pas d'origine thermique (lumière froide).
• La luminescence résulte de la désexcitation d'atomes ou de molécules et dépend de la nature de ces espèces.
• Les types de luminescence se distinguent par le mode d'excitation des atomes ou des molécules.

Différents Types de Luminescence

• Photoluminescence (Fluorescence et Phosphorescence): Excitation par lumière UV ou visible.
• Électroluminescence: Excitation par champ électrique.
• Chimiluminescence : Excitation par réaction chimique.
• Bioluminescence : Excitation par réaction enzymatique.
• Cathodoluminescence : Excitation par électrons accélérés.
• Radioluminescence: Excitation par RX, rayonnement α, β, γ.
• Triboluminescence: Excitation par frottement, rupture ou déformation.
• Sonoluminescence: Excitation par ultrasons.
• Thermoluminescence: Excitation par élévation de température.

Origine de la Photoluminescence

Absorption

• Il s'agit de la transition radiative d'un état électronique inférieur vers un état électronique supérieur d'une molécule.
• L'énergie du photon est convertie en énergie interne de la molécule.
• Sous excitation lumineuse, une molécule passe du niveau vibrationnel le plus bas V₀ de l'état fondamental S₀ vers un niveau vibrationnel Vᵢ des états excités singulet S₁ par l'absorption instantanée d'un photon.
• Les électrons et ceux des molécules environnantes de solvant se rééquilibrent rapidement, mais les positions des noyaux des atomes restent identiques à celles de l'état S₀.

Relaxation Vibrationnelle

• C'est une transition non radiative vers un niveau vibratoire inférieur au sein d'un même état électronique.
• Une molécule à l'état excité retourne à l'état fondamental S₀ en dissipant l'énergie par des relaxations vibrationnelles intramoléculaires ou intermoléculaires rapides jusqu'à atteindre le niveau V₀ de l'état S₁.

Conversion Interne

• C'est une transition non radiative entre deux états électroniques de même multiplicité de spin.
• Une molécule dans un état singulet de niveau S₁ peut subir une conversion interne rapide vers un état singulet de niveau Sᵢ₋₁.
• La conversion interne est suivie d'une relaxation vibrationnelle jusqu'au niveau V₀ de l'état Sᵢ₋₁.
• La conversion interne entre S₁ et S₀ se produit moins rapidement et entre en concurrence avec la fluorescence et le croisement inter-système.

Fluorescence

• C'est une transition radiative entre deux états électroniques de même multiplicité de spins.
• Elle correspond à l'émission de photons lors de la transition radiative du niveau V₀ de l'état S₁ vers l'état S₀.
• La règle de Kasha stipule que la fluorescence n'a lieu avec un rendement appréciable qu'à partir de l'état excité le plus bas S₁ en raison de la perte d'énergie préalable.
• Déplacement de Stokes: la fluorescence se produit à une longueur d'onde plus grande que l'absorption.

Phosphorescence

• C'est une transition non radiative entre deux niveaux vibrationnels de même énergie appartenant à des états électroniques de multiplicité de spin différente, suivie d'une transition radiative entre deux états électroniques de multiplicité de spin différente.
• Si la relaxation vibrationnelle est lente, il y a retournement de spin d'un électron de l'état singulet S₁ pour conduire à un état triplet T₁ plus stable.
• La phosphorescence correspond au retour au niveau S₀ ralenti par un nouveau retournement du spin de cet électron.

Tracés et Molécules Fluorescentes

Exemples de Molécules Fluorescentes

• La quinine, un fluorophore présent dans l'eau tonique.
• La lueur verte ou rouge-orange de l'antigel peut être due à la fluorescéine ou la rhodamine, également utilisées dans les lasers à colorant, comme la pyridine 1.
• Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comme l'anthracène et le pérylène sont fluorescents et utilisés pour surveiller la pollution pétrolière.
• Le POPOP et l'acridine orange sont utilisés pour le comptage par scintillation et comme colorant d'ADN.

Caractéristiques des Molécules Fluorescentes

• La fluorescence est favorisée par les molécules cycliques, rigides avec des liaisons π.
• Elle est renforcée par des groupes électro-donneurs (-NH₂, -OH, -X) et diminuée par des groupes électro-attracteurs (-COOH, -NO₂).
• Elle dépend du pH et du solvant.
• Les molécules non rigides perdent l'énergie absorbée par relaxation vibrationnelle.
• Les substances fluorescentes sont des molécules rigides comportant des systèmes aromatiques, des groupements carbonyles dans le cycle, des hétérocycles condensés et des doubles liaisons conjuguées.
• La partie de la molécule responsable de la fluorescence est le fluorophore.

Spectres de Fluorescence

• Un spectre de fluorescence est un tracé de l'intensité de fluorescence (I) en fonction de la longueur d'onde d'émission (λem), réalisé en maintenant la longueur d'onde d'excitation (λex) constante.
• La mesure est effectuée avec la source d'excitation allumée, nécessitant la différenciation entre la lumière de la source et celle de fluorescence.
• Les spectres d'absorbance et de fluorescence sont combinés sur un même graphe avec une double échelle.
• λex, λem et I peuvent être reliées sous forme d'un spectre à 3 dimensions.

Lois de Fluorescence

Loi de Stokes

• Les composés fluorescents excités par une source UV/Vis réémettent quasi-instantanément l'énergie absorbée sous forme d'un rayonnement dont le maximum d'émission (λem) est supérieur à la longueur d'onde d'excitation (λex).
• La loi s'écrit: λem = λex

Loi de Décroissance de l'Intensité de Fluorescence

• Après l'arrêt de la lumière excitatrice, l'intensité du flux lumineux émis (If) décroît exponentiellement avec le temps.

• Les lois de décroissance s'appliquent à la fluorescence et à la phosphorescence.

• La différence réside dans la valeur de la constante k.

• La fluorescence correspond à une décroissance quasi-instantanée, contrairement à la phosphorescence, qui est plus lente.

• La durée de vie de fluorescence (τ₀) est définie par τ₀ = 1 / k.

• Les valeurs de τ₀ sont de l'ordre de quelques nanosecondes, nécessitant des instruments conçus pour des mesures en régime stationnaire (en maintenant l'excitation).

• En phosphorescence, τ₀ peut dépasser plusieurs secondes, nécessitant des mesures après excitation.

• La sensibilité en fluorimétrie est souvent 1000 fois supérieure à celle de l'absorption UV-visible.

Aspect Quantitatif de la Fluorescence

Rendement Quantique de Fluorescence

• Pour les solutions, le rendement quantique de fluorescence (Φf) est défini comme le rapport entre le nombre de photons émis et le nombre de photons absorbés.
• Φf représente l'efficacité d'émission d'un fluorophore (Φf = 1 étant le rendement maximal).

Relation Entre Fluorescence et Concentration

• Les mesures de fluorescence sont caractérisées par une sensibilité élevée et une excellente sélectivité.
• La sensibilité peut être augmentée en augmentant l'intensité de la radiation excitatrice (Io), contrairement à la spectrophotométrie d'absorption.

Courbe de Calibration

• Aux concentrations élevées, une déviation par rapport à la linéarité est observée en raison de l'auto-absorption et de l'effet de Quench.
• Le domaine de linéarité est plus faible qu'en spectrophotométrie.
• Les dosages par fluorimétrie utilisent des méthodes d'étalonnage classiques ou des ajouts dosés, nécessitant des solutions très diluées.

Phénomènes de Diffusion

Diffusion Rayleigh

• Si λex et λem sont proches, il y a un risque de confusion entre la fluorescence et les émissions parasites dues au solvant.
• La diffusion Rayleigh est la réémission, à la même longueur d'onde, d'une petite fraction de la lumière excitatrice par le solvant.
• Son intensité dépend de la polarisabilité des molécules du solvant.
• La diffusion Rayleigh est de 100 à 1 000 fois plus forte que la diffusion Raman.

Diffusion Raman

• La diffusion Raman provient du transfert d'une partie de l'énergie de la lumière excitatrice aux molécules de solvant, qui réémettent des photons de moindre énergie.
• Le pic Raman est déplacé vers les grandes longueurs d'onde.
• Pour chaque solvant, si λex et λem sont proches, il ne faut pas confondre la fluorescence et les deux diffusions.

Instrumentation en Spectrofluorimétrie

Spectrofluorimètre

• Les sources lumineuses d'excitation sont des lampes à décharge sous pression de gaz (lampe à arc xénon de 150 à 800 watts).
• En fluorescence, l'échantillon se comporte comme une source émettant dans toutes les directions.
• L'intensité du rayonnement de fluorescence est mesurée perpendiculairement à la direction du trajet lumineux d'excitation.
• Un monochromateur d'émission est utilisé pour éliminer les traces de la lumière d'excitation avant la mesure de la fluorescence.
• La mesure de l'intensité lumineuse est faite par un photomultiplicateur ou une photodiode.

Enregistrements

• Les spectrofluorimètres disposent de deux monochromateurs motorisés pour enregistrer :
• le spectre d'émission en maintenant λex fixe,
• le spectre d'excitation en maintenant λem fixe,
• le spectre synchrone en faisant varier λex et λem tel que Δλ = λem - λex = constante.
• Les spectrofluorimètres disposent de logiciels pour trouver le meilleur couple λex / λem.

Mode Opératoire

• Une méthode manuelle consiste à utiliser "un seul facteur à la fois":

1. enregistrer le spectre UV du composé avec un spectrophotomètre UV/Vis.
2. se placer à la position du maximum du spectre d'absorption (λabs).
3. enregistrer le spectre de fluorescence.
4. régler le monochromateur d'émission à λem et faire varier λex.

• On obtient ainsi le spectre d'excitation qui permet un meilleur choix de la radiation excitatrice (qui peut être distincte de celle correspondant au maximum d'absorption du spectre UV).