Spectrométrie de fluorescence en biochimie

Partie 1 : Techniques spectroscopiques

• Techniques spectroscopiques incluent l'introduction à la spectroscopie, la spectrométrie d'absorption de l'ultraviolet et du visible (UV-Visible), la spectrométrie infrarouge (IR).
• La spectrométrie de fluorescence (fluorimétrie ou spectrofluorimétrie).
• Spectrométrie de fluorescence des rayons X (FX).
• Diffraction des rayons X (DRX).
• Spectrométrie d'Absorption Atomique (AA).
• Spectrométrie d'émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP).

I - Principes de Base et Théorie : Le domaine spectral

• La spectrométrie de fluorescence moléculaire étudie l'émission de lumière par des molécules en solution après excitation par des photons dans le domaine du visible ou du proche ultraviolet.
• Des longueurs d'onde spécifiques sont utilisées (10 nm à 30 cm).
• Les différentes régions spectrales sont définies (Lointain UV, Proche UV, Visible, IR proche, IR moyen, et IR lointain jusqu'aux micro-ondes).
• Les différentes transitions énergétiques sont identifiées. (Excitation, électrons de valence, vibration, rotation et rotation moléculaire qui vont de 4000 cm-1 à 400 cm-1)

I- Principes de Base et Théorie : Terminologie

• La luminescence est une émission de rayonnements électromagnétiques visibles ou proches de l'ultraviolet.
• Plusieurs phénomènes de luminescence sont distingués selon la source d'énergie excitatrice, notamment la chimioluminescence, la bioluminescence, la thermoluminescence, l'electroluminescence et la photoluminescence.
• Chaque phénomène correspond à une source de l'énergie excitatrice spécifique (Réaction chimique, Réaction enzymatique, Chaleur, Courant électrique, Absorption de photons).

I- Principes de Base et Théorie : Photoluminescence

• La photoluminescence est un phénomène de luminescence dû à l'absorption de photons.
• La phosphorescence est une luminescence de longue durée (plusieurs minutes à plusieurs heures).
• La fluorescence est une luminescence de courte durée (quelques nanosecondes).

I- Principes de Base et Théorie : La spectrométrie de fluorescence ou Fluorimétrie

• La fluorimétrie regroupe deux techniques analytiques : la spectrométrie de fluorescence moléculaire et la spectrométrie de fluorescence atomique ou spectrométrie de fluorescence X, qui dépendent de l'analyte utilisé (molécule ou atome).
• Les domaines énergétiques associés à ces techniques sont le visible et le proche ultraviolet pour la fluorescence moléculaire, et les rayons X pour la fluorescence X.

I- Principes de Base et Théorie : Origine de la photoluminescence

• La fluorescence implique des transitions électroniques entre deux états énergétiques de même multiplicité (n → π* ou π → π*).

• La phosphorescence implique des transitions électroniques entre deux états énergétiques de multiplicités différentes (n → π* ou π → π*).

• La règle de multiplicité définit les états électroniques singulets et triplets. (M = 2S + 1. avec S = somme de ms où ms sont les nombres quantiques de spin.

• Etats électronique fondamental singulet : spins opposés ou antiparallèles (↑↓) M= 1

• Etats électronique excité singulet : spins opposés ou antiparallèles (↑↓) M= 1

• Etats électronique excité triplet : spins parallèles (↑↑) M= 3

I- Principes de Base et Théorie : Diagramme de Jablonski

• Le diagramme de Jablonski décrit les différents processus d'excitation et de désactivation des molécules.
• Les processus non radiatifs incluent la relaxation vibrationnelle, la conversion interne, la conversion inter-système.
• Les désactivations radiatives incluent la désactivation directe et la désactivation après changement de multiplicité.
• Etat électronique fondamental singulet(S₀)
• Premier état électronique excité singulet(S₁)
• Deuxième état électronique excité singulet(S₂)
• Premier état électronique excité triplet(T1)
• Deuxième état électronique excité triplet(T₂)

I- Principes de Base et Théorie : Spectrométrie de fluorescence moléculaire Aspects qualitatifs

• La spectrométrie de fluorescence moléculaire mesure l'intensité de la lumière fluorescente émise (If) par rapport à un étalon.
• Le spectre de fluorescence est une image inversée du spectre d'absorption dans un milieu transparent. Cela permet de différencier la fluorescence de la lumière transmise.
• Un milieu est transparent en fluorimétrie s'il n'a pas d'absorbants, une faible diffusion et une faible auto-fluorescence aux longueurs d'onde utilisée. L'absence de substances qui absorbent la lumière à l'excitation (ou emission) est importante.
• L'absence de substances qui absorbent la lumière (avec des collisions) et d'auto-fluorescence (émission d'autres composés) est essentielle pour l'analyse correcte.

I- Principes de Base et Théorie : Spectrométrie de fluorescence moléculaire Aspects quantitatifs

• Le rendement quantique de fluorescence (Φf) mesure l'efficacité d'une molécule à fluorescer; c'est le rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés (0<Φf<1).
• L'intensité de fluorescence (I₁ ) dépend de Φf , de l'intensité du rayonnement incident (Io), de la concentration (C), d'un facteur k qui dépend de l'appareillage et du composé. I = K .C

I- Principes de Base et Théorie : Les espèces fluorescentes (fluorophores)

• Les fluorophores, sont généralement des composés aromatiques possédant des propriétés spécifiques: Absorption UV et visible,coefficient d'extinction molaire importants, rendement quantique élevé (0.8-0.9), une courte durée de vie (≈ ns), grand décalage de STØKES.

I- Principes de Base et Théorie : Facteurs influençant la fluorescence

• La fluorescence est favorisée par des molécules cycliques, rigides et comportant des liaisons π. L'effet de la polarité du solvant et le pH influencent aussi la fluorescence. La présence de groupements électrodonneurs augmente la fluorescence tandis que les groupements électroattracteurs la diminuent.

II- Instrumentation : Spectrofluorimètres / Source de lumière

• Les spectrofluorimètres utilisent des lampes à arc xénon pour fournir une lumière intense sur toute la gamme UV-VIS.
• Ces lampes produisent un spectre continu. La haute intensité de la source permet une excitation efficace des molécules et donc une production de signaux plus forts

II- Instrumentation : Spectrofluorimètres / Détecteur

• Un photomultiplicateur (PM) est un détecteur de lumière sensible qui transforme le signal lumineux en un signal électrique.
• Le PM comporte une photocathode, une série de dynodes et une anode.
• Le processus d'amplification par les dynodes produit un courant mesurable, plus élevé que le courant initial.

III- Applications

• La spectrométrie de fluorescence est utilisée dans la biochimie et la biologie moléculaire pour étudier les interactions protéine-protéine, la pharmacologie pour mesurer les concentrations médicamenteuses, la chimie environnementale pour analyser des composés organiques en traces.
• Elle est aussi utilisée en agroalimentaire pour évaluer la qualité des aliments, et dans d'autres domaines.

5. Transformation chimique (Dérivatisation de fluorescence)

• La dérivatisation est une technique pour augmenter la sensibilité de détection de certaines molécules, notamment en chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Elle transforme des molécules non fluorescentes en dérivés hautement fluorescents.
• Des réactifs courants sont utilisés comme le 1,2-phénylènediamine, le chlorure de dansyle, l'O-phthalaldéhyde et l'hydroxyméthyl-9-anthracène.

Ce quiz explore les principes de la spectrométrie de fluorescence, y compris le rôle des dynodes dans les photomultiplicateurs et leurs applications en biochimie. Vous serez interrogé sur des concepts tels que la phosphorescence, la caractéristique des états électroniques, et l'analyse environnementale. Testez vos connaissances sur ce domaine fascinant !