Sérologické metody

### Sérologické metody

• Reakce protilátek (Ab) s antigeny (Ag) uvnitř těla in vitro.
• Dvě fáze:
  • Specifická vazba: Rychlá vazba Ag determinanty a vazebného místa Ab, není viditelná.
  • Nespecifická fáze: Vizualizace reakce, vznik prostorového komplexu, viditelná reakce.
• Použití:
  • Přímý průkaz Ag ve vzorku.
  • Nepřímý průkaz Ab v séru.
• Rozdělení podle typu průkazu (povahy Ag):
  • Precipitace.
  • Aglutinace.
  • Vazba komplementu.
  • Neutralizace.
  • Reakce se značenými složkami.
• Povaha Ag:
  • Rozpustný (koloidní = solubilní).
  • Korpuskulární (částicový, nerozpustný): Část nebo celá bakterie, latexová částice s Ag.
• KFR – pozitivní & negativní reakce: Hemolýza senzibilizovaných erytrocytů v závislosti na přítomnosti komplementu.
• Neutralizace: Protilátka blokuje biologické účinky Ag, průkaz na vhodném systému.
  • ASLO: Průkaz antistreptolyzinu O, indikátor – králičí erytrocyty.
  • Virusneutralizační test (VNT).
  • Hemaglutinačně inhibiční test (HIT).
• Reakce se značenými složkami: Jedna složka reakce je označena, průkaz Ag & Ab.
  • Fluorescenční barvivo: Imunofluorescence.
  • Enzym: Imunoenzymatické testy (ELISA).
  • Radioizotop: Radioimunoanalýza (RIA).
  • Těžký kov: Imunoelektronoptické reakce.
• Imunofluorescence (IF): Jedna složka je označena fluorescenčním barvivem, odeznívá pomocí fluorescenčního mikroskopu.
  • Přímá IF: Průkaz Ag.
  • Nepřímá IF: Použití Ab proti Ab.
• Imunoenzymatické techniky (EIA): Jedna složka reakce je označena enzymem, ke znázornění výsledku se přidá substrát, který enzym rozloží za vzniku barevného nebo luminiscenčního produktu.
  • Vyhodnocení: Intenzita zbarvení - na přístroji (reader), měření tzv. optické denzity OD při specifické vlnové délce.

Molekulární metody

• Průkaz bakteriálních NK.
• Velmi citlivé, specifické, rychlé, ale drahé.
• Průkaz NK i z mrtvých buněk.
• Náchylné na kontaminaci.
• Stavba NK: Dusíkaté báze (A, G, C, T, U), cukr (ribóza/deoxyribóza), fosfát.
  • DNA: A, G, C, T.
  • RNA: A, G, C, U.
• Komplementární párování bazí: C=G, A=T, A=U.
• Hybridizační metody:
  • Přidání „sondy” – označený úsek DNA specifické pro určitý druh.
  • Vážou se k sobě DNA vzorku a sondy, pokud je ve vzorku přítomen daný druh.
  • Odeznívá se na luminometru.
• Amplifikační metody: Zmnožení NK ve vzorku – PCR, LCR, NASBA.
  • PCR: Opakované cykly v termocykleru (denaturace, annealing, elongace).
  • Amplikony se prokazují elektroforézou nebo DNA sondou.
• Sekvenační techniky: Určení sekvence nukleotidů (IgA, IgG).
  • IgA: Vytratí se během 1 - 2 týdnů, průkaz = čerstvá infekce.
  • IgG: Vytratí se pozvolně, vrchol za měsíc, můžou přetrvávat déle.

Interpretace mikrobiologického nálezu

• Index pozitivity (IP): Bezrozměrné číslo, vyjadřuje poměr naměřené hodnoty séra a hodnoty standardního séra.
  • Negativní: IP < 0,9.
  • Pozitivní: IP > 1,1.
  • Hraniční: 10% kolem hodnoty standardního séra IP = 0,9-1,1.
• Laboratorní charakteristiky: Specificita a senzitivita:
  • Senzitivita: Správný záchyt nemocných.
  • Specifita: Správná negativita u zdravých.
• Laboratorní chyba: Nepřesnost pomůcek, špatné výsledky měření, lidský faktor.
• Interpretace nálezů: Vždy v souvislosti s klinickým stavem pacienta a jeho dalšími nálezy. - Nikdy se neléčí laboratorní nález, ale vždy nemoc pacienta.
• Dynamika titrů protilátek:
  • Různý vývoj titrů protilátek v čase.
  • Důležitá pro diagnostiku.
  • Často se používá dynamika IgG a IgM.
• Sérologické markery VHA: Důležité pro diagnostiku virové hepatitidy A, B, C.
  • Sérologické markery akutní VHB.

### Poznámky

• Text je pouze shrnutím klíčových aspektů z přednášky.
• Podrobnější informace najdete v odborné literatuře a zdrojoch uvedených v přednášce.
• Výše uvedené informace by vám měly sloužit jako vodítko při přípravě na seminář a zkoušky.

Imunochromatografické testy (ICH)

• Využívají se pro rychlou a jednoduchou diagnostiku infekcí.
• Testovací a kontrolní linie jsou umístěny na pevné fázi.
• Vzorek se pohybuje porézní vrstvou a reaguje s testovacím a kontrolním místem.
• Výsledek je viditelný do několika desítek minut.
• Pozitivní výsledek: Viditelný proužek v testovací i kontrolní linii.
• Negativní výsledek: Viditelný proužek pouze v kontrolní linii.
• Často se používají jako POCT (testování u lůžka pacienta).

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

• Metoda pro detekci antigenů a protilátek.
• Využívá specifické protilátky a enzymy vázané na protilátky.
• Přímá ELISA: Pro detekci antigenů.
• Nepřímá ELISA: Pro detekci specifických protilátek nebo antigenů.
• Sendvičová ELISA: Pro detekci antigenu, kde antigen je "zasvěcen" mezi dvě protilátky.
• Vysoká citlivost a specifita.

Komplement fixační reakce (KFR)

• Metoda pro detekci protilátek.
• Vyžaduje přesné ředění všech složek a kontrol.
• Skládá se z antigenu, protilátky, komplementu a indikátoru.
• Princip: Komplement se váže na komplex antigenu a protilátky, čímž se aktivuje indikátor a reakce je viditelná.

Elispot

• Metoda pro kvantifikaci buněk produkujících cytokiny nebo imunoglobuliny.
• Využívá se pro detekci specifických buněk imunitního systému.
• Princip: Jedna reagující buňka vytváří jeden spot, který se dá vizualizovat.

Imunoblot (Western blot)

• Metoda pro identifikaci specifických proteinů v komplexní směsi.
• Princip: Směs proteinů se separuje elektroforézou a poté se přenese na membránu.
• Na membránu se aplikují specifické protilátky, které se váží na cílový protein.
• Využívá se pro diagnostiku infekčních chorob a pro identifikaci proteinů s klinickým významem.

Molekulární testy

• Využívají se pro detekci bakteriálních nukleových kyselin.
• Výhody: Vysoká citlivost, specifita a rychlost.
• Nevýhody: Drahé, citlivé na kontaminaci.

Hybridizační metody

• Využívají se k identifikaci mikroorganismů na základě jejich specifické DNA.
• Princip: Specifická sonda se váže na cílovou DNA ve vzorku a po detekci sondy se zjišťuje přítomnost daného mikroorganismu.
• Výhody: Rychlé, specifické.
• Nevýhody: Méně citlivé, potřebuje se více DNA ve vzorku.

Amplifikační metody

• Zmnožují cílový úsek DNA, čímž zvyšují detekční limit.
• Nejčastější metoda: PCR (polymerázová řetězová reakce).
• Princip: Cílová DNA se množí opakovanou replikací, čímž se zvětšuje počty replikací cílové DNA.

Sekvenace DNA

• Stanovení pořadí nukleotidů v DNA.
• Využití: Diagnostika infekčních chorob, identifikace mikroorganismů, hledání mutací a diagnostika genetických onemocnění.

Interpretace mikrobiologických nálezů

• Zohledňuje se stav pacienta, typ vzorku, metoda analýzy a související faktory.
• Diagnostika přímá: Prokazuje přítomnost mikroba nebo jeho částí (mikroskopie, kultivace, detekce antigenů, NK, pokus na zvířeti).
• Diagnostika nepřímá: Prokazuje imunitu organismu (detekce protilátek, buněčná imunita).
• Falešná negativita: Výsledek testu je negativní, i když je pacient infikován.
• Falešná pozitivita: Výsledek testu je pozitivní, i když je pacient neinfikován.

Pojmy

• Titr protilátek: Koncentrace protilátek v séru.
• Index pozitivity: Poměr titru protilátek v séru pacienta k referenční hodnotě.
• Dynamika protilátek: Změna titru protilátek v čase.
• Anamnestický titr: Titr protilátek po předchozí infekci.
• Čtyřnásobný vzestup titru: Čtyřnásobné zvýšení titru protilátek v čase.
• Sérokonverze: Změna titru protilátek z negativního na pozitivní.
• Specifita: Schopnost metody detekovat specifické protilátky nebo antigeny.
• Senzitivita: Schopnost metody detekovat protilátky nebo antigeny i při nízké koncentraci.
• Laboratorní chyba: Chyba způsobená v laboratorním procesu.

Tento kvíz se zaměřuje na sérologické metody používané k detekci protilátek a antigenů v těle. Prozkoumáte různé fáze reakce, typy průkazů a významné testy jako je ASLO a virusneutralizační test. Tento kvíz vám pomůže porozumět podstatě sérologických technik a jejich aplikacím.