lezione 4.1

Replicazione del DNA

• La DNA polimerasi catalizza la sintesi del DNA molto rapidamente.
• La DNA ligasi sigilla le interruzioni nel filamento di DNA.
• L'RNA primer fornisce un punto di partenza per la sintesi del DNA.
• La DNA primasi sintetizza l'RNA primer.
• La topoisomerasi allevia la tensione causata dallo svolgimento del DNA.
• I frammenti di Okazaki sono brevi segmenti di DNA sintetizzati sul filamento lagging.
• L'elicasi svolge la doppia elica del DNA per consentire la replicazione.

Filamenti Leading e Lagging

• Il filamento leading è sintetizzato continuamente nella direzione della forcella di replicazione.
• Il filamento lagging è sintetizzato in modo discontinuo in brevi frammenti (frammenti di Okazaki) a ritroso rispetto alla direzione di replicazione.

Origine di Replicazione

• L'origine di replicazione del cromosoma di E. coli (ori) ha una dimensione di 245 bp.
• Le proteine DnaA (elicasi) si legano alle quattro sequenze di 9 bp e denaturano il DNA in tre ripetizioni di 13 bp ricche di A=T, aprendo il DNA.

DnaA e Replicazione

• 20 proteine DnaA (elicasi) si legano alle quattro sequenze di 9 bp e denaturano il DNA.
• DnaA apre il DNA.

DNA Polimerasi

• La sintesi del DNA avviene in direzione 5' a 3'.
• La DNA polimerasi necessita di un filamento primer esistente per iniziare la sintesi.
• Ci sono quattro tipi principali di DNA polimerasi: Pol I, Pol II, Pol III, Pol IV, Pol V.

Funzioni delle DNA Polimerasi Procariotiche

• DNA Pol I ripara e sintetizza il filamento lagging
• DNA Pol II ripara
• DNA Pol III è l'enzima principale della replicazione
• DNA Pol IV , DNA Pol V translesioni

Subunità della DNA Polimerasi III di E. coli

• α: polimerizzazione
• ε: esonucleasi 3'→5' (correzione di bozze)
• θ: polimerizzazione
• τ: legame stabile del templato; dimerizzazione dell'oloenzima
• γ: complesso caricatore della pinza: carica le subunità β sul filamento lento ad ogni frammento di Okazaki
• δ: complesso caricatore della pinza: carica le subunità β sul filamento lento ad ogni frammento di Okazaki
• δ': complesso caricatore della pinza: carica le subunità β sul filamento lento ad ogni frammento di Okazaki
• χ: complesso caricatore della pinza: carica le subunità β sul filamento lento ad ogni frammento di Okazaki
• ψ: complesso caricatore della pinza: carica le subunità β sul filamento lento ad ogni frammento di Okazaki
• β: pinza del DNA necessaria per la massima processività

Utilizzo esclusivo di dNTP da parte della DNA polimerasi

• La DNA polimerasi utilizza esclusivamente dNTP (deossinucleotidi trifosfati) e non rNTP (nucleotidi trifosfati)
• L'aggiunta di un 2’-OH determina un ingombro sterico incompatibile con gli amminoacidi (detti "discriminatori”) presenti nella tasca di legame del nucleotide.

Corretto Appaiamento

• L'appaiamento corretto A:A allontana il fosfato α dal nucleotide che deve essere polimerizzato, il che riduce la catalisi.

Struttura della DNA Polimerasi

• La struttura tridimensionale della DNA polimerasi ricorda una mano destra.
• Il DNA neosintetizzato è associato al dominio a palmo della DNA polimerasi.
• Il legame fosfodiesterico dello stampo si piega bruscamente di 90° quando il DNA deve stare nel sito attivo.
• dNTP corretto causa rotazione di 40 gradi delle eliche nel dominio a forma di dita (elica O)

Nei procarioti (E. coli)

• Pol I rimuove il primer a RNA, ripara il DNA.
• Pol II (Din A) ripara il DNA.
• Pol III è formato da 3 subunità.
• Pol III oloenzima ha 9 subunità.
• Pol IV (Din B) ripara il DNA, sintetizza le translesioni (TLS).
• Pol V (UmuC, UmuD2'C) translesioni.

Proteine

• Nella replicazione sono richieste diverse proteine.
• La proteina DnaA riconosce la sequenza di origine e apre il duplex in posizioni specifiche nell'origine.
• La proteina DnaB (elicasi) svolge il DNA.
• La proteina DnaC è necessaria per il legame di DnaB all'origine.
• HU è una proteina istone-simile, piega il DNA e stimola l'inizio.
• La primasi (proteina DnaG) sintetizza i primer di RNA.
• La proteina legante il DNA a singolo filamento (SSB) lega il DNA a singolo filamento.
• L'RNA polimerasi facilita l'attività di DnaA.
• La DNA girasi (DNA topoisomerasi II) allevia la tensione torsionale generata dallo svolgimento del DNA.
• Essenziale anche la dam metilasi.
• Anche l'origine di replicazione di E.coli è coinvolta nel processo di distribuzione dei cromosomi nelle cellule figlie.

Velocità di replicazione

• Il genoma dell'E. coli impiega circa 20 minuti per replicarsi.
• La velocità di replicazione negli eucarioti è almeno 10 volte inferiore (circa 50 bp/s).
• Il genoma umano si replica in media in 8 ore, utilizzando 30,000-80,000 origini.

Origini e Replicazione

• E.COLI: 1 origine, 4,6x106 bp (un unico REPLICONE!)
• LIEVITO: 500 origini, ARS 180bp sequenza consensus ben definita
• TOPO: 25.000 origini, 120kb repliconi
• UOMO: 30.000-80.000 origini
• La lunghezza media dei repliconi è costante 40-100kb

Frammenti di Okazaki

• E.COLI: 1000-2000bp
• UOMO: 100-200bp
• La struttura della cromatina rende la sintesi del DNA molto più complicata.

Enzimi che intervengono nella replicazione del DNA

• Elicasi: E. coli: DnaB, Uomo (modello SV40): Mcm2-7 (antigene T)
• Elicasi di caricamento/primasi: E. coli: DnaC, Uomo (modello SV40): Mcm2-7 (antigene T)
• Mantenimento del singolo filamento: E. coli: SSB, Uomo (modello SV40): RPA
• Innesco: E. coli: DnaG (primasi), Uomo (modello SV40): Pol α/primasi
• Pinza scorrevole: E. coli: β, Uomo (modello SV40): PCNA
• Caricamento della pinza (ATPasi): E. coli: Complesso γδ, Uomo (modello SV40): RFC
• Allungamento del filamento: E. coli: Pol III, Uomo (modello SV40): Pol δ/Pol ε
• Rimozione dell'RNA primer: E. coli: Pol I, Uomo (modello SV40): FEN-1, Rnasi H1
• Legatura dei frammenti di Okazaki: E. coli: Ligasi, Uomo (modello SV40): Ligasi I

Terminazione della replica

• La replicazione termina quando due forcelle di replicazione si incontrano in una regione terminale sul cromosoma circolare.
• Questa regione contiene copie multiple di una sequenza di 20 coppie di basi chiamata Ter ("termine").
• La proteina Tus (terminus utilization substance) si lega alla sequenza Ter
• Un complesso funzionale Tus-Ter arresta la forcella di replicazione che incontra e l'altra forcella si arresta una volta incontrata la prima forcella.
• La sequenza Ter è costruita in modo da agire come una trappola, dove una forcella di replicazione può entrare ma non uscire

Metilazione

• Solo le origini completamente metilate possono iniziare la replicazione; le origini figlie emimetilate non possono essere riutilizzate finché non sono state ripristinate allo stato completamente metilato.
• Le origini completamente metilate sono attive mentre quelle emimetilate sono inattive.
• La Dam metilasi è importante nella metilazione del DNA
• Un inibitore legato alla membrana si lega al DNA emimetilato sull'origine e può funzionare impedendo il legame di DnaA.
• Viene rilasciato quando il DNA viene rimetilato
• Methylation of the N6 position of Adenine
• Dam: DNA adenine methylation