Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Introducción a la PCR

• La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica molecular que permite la amplificación exponencial de fragmentos de ADN.
• Fue desarrollada por Kary Mullis en 1983 y revolucionó el campo de la genética, la biotecnología y la medicina.

Características de la PCR

• Especificidad: amplifica únicamente la secuencia de ADN objetivo.
• Eficiencia: el número de copias máximo que se puede obtener en un determinado número de ciclos.
• Reproducibilidad: fácilmente reproducible.

Componentes Esenciales de la PCR

• Template DNA: contiene la región de ADN que se va a amplificar.
• Primers: secuencias cortas, de 18 a 30 nucleótidos, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Delimitan la zona de ADN a amplificar.
• dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
• Polimerasa: la más común es la Taq Polimerasa, que tiene una temperatura óptima de funcionamiento de 70°C.
• Cofactores: cloruro de magnesio (MgCl2).
• Solución buffer: mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la polimerasa.

Fases de una PCR

• Desnaturalización: rompe las dobles hélices de ADN.
• Annealing: los primers se unen a la región específica de ADN.
• Extensión: la polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN, colocando nucleótidos complementarios.

Preparación de la Reacción

• Preparación de la muestra de ADN: se extrae por método de columnas.
• Preparación del MasterMix: se mezclan los componentes esenciales en una solución buffer.
• Carga del MasterMix en cada tubo o pocillo: se adiciona la muestra de ADN para llega a un volumen final de 20 µL.

Termociclador

• Protocolo de amplificación de la PCR: se establecen las condiciones de temperatura y tiempo para cada fase de la PCR.
• Etapas del protocolo: desnaturalización inicial, desnaturalización, annealing, extensión, extensión final y cooling.

Variantes de la PCR

• PCR convencional (Punto final)
• PCR en tiempo real (qPCR RT-qPCR)
• PCR Anidada
• PCR Multiplex
• PCR de Transcripción Inversa (RT-PCR)

Objetivos de la PCR

• Comprender los fundamentos teóricos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
• Familiarizarse con los componentes esenciales de la PCR y su función
• Explorar los diferentes tipos de PCR y sus aplicaciones

Componentes Esenciales de la PCR

• Template DNA: contiene la región de ADN que se va a amplificar
• Primers: Forward y Reverse, secuencias cortas que permiten que la polimerasa inicie la reacción
• dNTPs: desoxirribobucléotidos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
• Polimerasa: la más común es la Taq Polimerasa, que sintetiza una nueva cadena de ADN
• Cofactores: Cloruro de magnesio (MgCl2)
• Solución buffer: mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la polimerasa

Fases de la PCR

• Desnaturalización: separación de las dos cadenas de ADN
• Annealing: unión de los primers a la cadena de ADN
• Extensión: síntesis de la nueva cadena de ADN por la polimerasa

Variantes de PCR

• PCR convencional (Punto final)
• PCR en tiempo real (qPCR o RT-qPCR)
• PCR Anidada
• PCR Multiplex
• PCR de Transcripción Inversa (RT-PCR)

Preparación de la Reacción

• Preparación del Template DNA: extracción de ADN humano mediante método de columnas
• Selección de la región a amplificar: gen de betaglobina humana
• Diseño de los primers: Forward y Reverse, con secuencias específicas
• Preparación del Master Mix: mezcla de los componentes esenciales de la PCR