42 Questions
¿Cuál es el objetivo principal de la técnica de PCR?
Amplificar la cantidad de DNA de una muestra
¿Cuáles son los pasos de temperatura involucrados en la técnica de PCR?
94°C, 60°C y 72°C
¿Cuántas copias de DNA se pueden obtener después de 30 ciclos de PCR?
1.07 x 10^9
¿Cuál es el instrumento utilizado para realizar la técnica de PCR?
Un Thermal Cycler (termociclador)
¿Cuál es el propósito de utilizar la técnica de PCR en la detección de patógenos?
Detectar la presencia de bacterias o virus como HIV y COVID-19
¿Qué tipo de aplicaciones médicas se pueden realizar utilizando la técnica de PCR?
Detección de mutaciones en genes relacionados a enfermedades como fibrosis quística y anemia falciforme
¿Qué se requiere para que se realice la amplificación del DNA en la técnica de PCR?
Componentes como DNA, primers, nucleótidos y polimerasa
¿Cuál es el gen que se busca amplificar en este ejercicio de laboratorio?
El gen 16S rDNA del genoma de la cepa DH5α de Escherichia coli
¿Cuál es la temperatura utilizada durante el proceso de alineamiento en la reacción en cadena de la polimerasa?
47-60oC
¿Qué es lo que añade la Taq polimerasa durante la etapa de extensión?
dNTPs
¿Cuál es el propósito de la electroforesis en gel de agarosa en este experimento?
Determinar la presencia de productos específicos y no específicos, y detectar contaminación de DNA exógeno
¿Qué tamaño de producto específico se espera obtener en este experimento?
1.5 kb
¿Cuál es el propósito del control negativo en este experimento?
Detectar contaminación de DNA exógeno
¿Qué ocurre durante la etapa de extensión final?
Los extremos de los productos son completamente extendidos.
¿Cuál es la temperatura utilizada durante la etapa de extensión?
72oC
¿Qué es lo que se espera ver en los carriles con el control negativo?
No se espera ver bandas
¿Cuál es la fuente más común de contaminación de DNA exógeno en una reacción de amplificación?
Células epiteliales de manos, brazos y cara del estudiante o personas realizando la amplificación.
¿Qué es un 'primer dimer' y cómo se forma?
Un 'primer dimer' es la unión de 'primers' FW con FW, RV con RV o FW con RV, que se forma cuando hay cierta complementariedad de bases debido al diseño incorrecto de los mismos o cuando se trabaja con altas concentraciones de los 'primers'.
¿Cuál es la función del gen 16S rDNA en procariotas?
El gen 16S rDNA codifica para el rRNA que forma parte de la subunidad más pequeña del ribosoma procariota.
¿Qué tipo de secuencias contiene el gen 16S rDNA?
El gen 16S rDNA contiene secuencias conservadas de DNA común en todas las bacterias y secuencias variables únicas para cada especie de bacteria (polimorfismo).
¿Cuál es el objetivo de utilizar 'primers' universales en la amplificación del gen 16S rDNA?
El objetivo es amplificar una región conservada del gen 16S rDNA.
¿Cuál es el tamaño del producto específico (amplicon) esperado en la amplificación del gen 16S rDNA?
1.5 kilobases (kb) o 1500 pares de bases (bp).
¿Qué es el TM de un 'primer' y qué es su utilidad?
El TM (Temperature de Melt) es la temperatura a la que se produce la unión del 'primer' con el DNA. Su utilidad es determinar la temperatura óptima para la amplificación.
¿Qué es el significado de las letras M, W y R en la secuencia de los 'primers'?
M = A, C; W = G, T; R = Purinas (A y G)
¿Cuál es la función de los iniciadores (primers) en la reacción de PCR?
Unirse al extremo 3' del DNA de interés y proporcionar un sitio de inicio para la síntesis de DNA
¿Cuál es la temperatura óptima para la actividad de la DNA polimerasa Taq y Tth?
72°C
¿Qué es el buffer de Taq polimerasa o Tth en la PCR?
Un componente necesario para que la enzima DNA polimerasa pueda trabajar en forma óptima
¿Cuál es el papel del MgCl2 en la PCR?
Actúa como un cofactor necesario para que la DNA polimerasa pueda sintetizar DNA en forma óptima
¿Qué ocurre durante la etapa de desnaturalización inicial en la PCR?
La separación de la doble hebra de DNA y la formación de las hebras sencillas
¿Cuál es la función de la DNA polimerasa en la PCR?
Sintetizar DNA en forma óptima
¿Qué es la temperatura necesaria para la desnaturalización de la doble hebra de DNA durante la PCR?
94-97°C
¿Cuál es el propósito de los ciclos de desnaturalización en la PCR?
Permitir la síntesis de DNA a partir de los iniciadores y los nucleótidos trifosfatados
¿Cuántos µL de marcador 1 kb se utilizan en la preparación de la muestra?
8 µL
¿Qué función cumple el 'loading dye' en la preparación de la muestra?
Visualizar la migración de las muestras
¿Cuál es el propósito del Go Taq Green Master Mix en la reacción de PCR?
Contiene el 'loading dye' necesario para visualizar la migración de las muestras
¿Qué información se debe incluir en la parte superior de la figura del gel?
Identificar cada carril como M, 1, 2, 3, 4, etc.
¿Qué son los 'primer dimers' en la reacción de PCR?
Productos no específicos
¿Cuál es el propósito de la figura en el informe?
Visualizar los resultados de la reacción de PCR
¿Qué pasa si el 'primer' 'forward' y 'reverse' tienen secuencias de bases complementarias entre sí?
Se forma un 'primer dimer'
¿Cuántas copias se formaron del DNA original después de 30 ciclos?
2^30 = 1,073,741,824 copias
¿Qué es el producto específico amplificado en la reacción de PCR?
16S rDNA de 1.5 kb
¿Cuál es el propósito de la discusión en el informe?
Analizar y interpretar los resultados de la reacción de PCR
Study Notes
Técnica de PCR
- La técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) permite amplificar el DNA en una muestra, aumentando la cantidad de copias de una secuencia específica.
- La técnica involucra ciclos repetitivos de temperatura (94°C, 60°C y 72°C) para duplicar el DNA en forma exponencial.
- Después de 30 ciclos, se ha amplificado el DNA 2^30 = 1.07 x 10^9 veces.
Instrumentación y componentes
- El instrumento utilizado para realizar esta técnica es un "Thermal Cycler" (termociclador).
- Los componentes necesarios para la amplificación por PCR incluyen:
- DNA molde (template)
- Primers (forward y reverse)
- Desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs)
- DNA polimerasa (Taq o Tth)
- Buffer de Taq polimerasa o Tth
- MgCl2 (cofactor)
Gen 16S rDNA
- El gen 16S rDNA codifica para el rRNA que forma parte de la subunidad más pequeña del ribosoma procariota.
- El gen 16S rDNA contiene secuencias conservadas de DNA común en todas las bacterias.
- El gen 16S rDNA también contiene secuencias variables únicas para cada especie de bacteria (polimorfismo).
Primers universales
- Los primers universales utilizados para amplificar el gen 16S rDNA son:
- Forward 27f: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (20 bp, TM=65.1°C)
- Reverse 1525r: 5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3' (17 bp, TM=54.4°C)
Pasos de amplificación
- Etapa 1: Desnaturalización inicial (94-97°C) para asegurar la separación de la doble hebra de DNA y la formación de las hebras sencillas.
- Etapa 2: 30 ciclos de desnaturalización (94-97°C), unión de primers (annealing) y extensión (elongación) (72°C).
- Etapa 3: Extensión final (72°C) para asegurar la completa extensión de los productos.
Electroforesis en gel de agarosa
- La electroforesis en gel de agarosa permite determinar la presencia del producto específico (1.5 kb) en las muestras experimentales.
- La electroforesis también permite determinar la presencia de productos no específicos y la contaminación de DNA exógeno en las muestras.
Explore the principles and applications of the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique and its use in detecting the 16S rDNA gene. Learn about the characteristics of the 16S rDNA gene and how to amplify it from the genome of Escherichia coli. Test your knowledge of molecular biology and PCR techniques.
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