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PCR Technique: 16S rDNA Gene Detection

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Study Flashcards

45 Questions

¿Cuál es la temperatura óptima para la actividad de la enzima DNA polimerasa Taq?

72°C

¿Cuál es el propósito de los 'primers' en la amplificación de DNA?

Unirse a la hebra de DNA que se quiere amplificar

¿Cuál es la función de la DNA polimerasa Taq en la amplificación de DNA?

Sintetizar nueva hebra de DNA

¿Qué tipo de moléculas son los 'primers'?

Moléculas de DNA de hebra sencilla

¿Cuál es la función del MgCl2 en la amplificación de DNA?

Actuar como cofactor para la DNA polimerasa

¿Cuál es el objetivo de la etapa 1 de la amplificación de DNA?

Separar las hebras dobles de DNA

¿Cuál es la temperatura necesaria para la desnaturalización del DNA?

94-97°C

¿Cuál es el propósito del buffer de Taq polimerasa?

Proporcionar condiciones óptimas para la DNA polimerasa

¿Cuántas veces se repite la etapa 2 de la amplificación de DNA?

30 veces

¿Cuál es la temperatura utilizada en la etapa de alineamiento (annealing)?

47-60oC

¿Qué enzima reconoce los 'primers' y añade los dNTPs durante la extensión?

Taq polimerasa

¿Cuál es el propósito de la electroforesis en gel de agarosa?

Verificar la presencia del producto específico

¿Cuál es el tamaño esperado del producto específico?

1.5 kb

¿Qué se busca detectar en el control negativo?

La presencia de ADN exógeno

¿Cuál es la temperatura utilizada en la etapa de extensión?

72oC

¿Qué se forma durante la etapa de extensión?

Hebras complementarias

¿Qué se utiliza en el control negativo?

Agua ultrapura

¿Qué puede alterar la veracidad de los resultados?

La contaminación con ADN exógeno

¿Cuál es el nombre de la técnica que permite aumentar la cantidad de DNA en una muestra?

Reacción en Cadena de la Polimerasa

¿Cuál es el instrumento utilizado para realizar la técnica de PCR?

Termociclador

¿Cuántas veces se duplica el DNA en cada ciclo de la técnica de PCR?

Exponencialmente

¿Cuál es el propósito de la técnica de PCR en la detección de patógenos?

Para identificar bacterias

¿Cuál es el nombre del gen que se busca amplificar en este ejercicio?

16S rDNA

¿Cuántos ciclos se requieren para amplificar el DNA 230 veces?

30 ciclos

¿Qué es lo que se requiere para que se realice la amplificación del DNA?

Los componentes específicos de la reacción

¿Qué es posible detectar utilizando la técnica de PCR?

Todas las opciones anteriores

¿Cuál es el propósito de la técnica de PCR en la identificación de individuos?

Para identificar individuos en casos criminales

¿Cuál es el nombre del kit que se utiliza en este procedimiento?

Go Taq Green Master Mix

¿Cuál es la concentración final de los cebadores FW y RV?

0.4µM

¿Cuál es el propósito del marcador 1 kb?

Providing a known size standard

¿Cuántos microlitros de 'master mix' se transfieren a cada microtubo de PCR?

24 μL

¿Qué es necesario hacer con el kit Go Taq Green MasterMix antes de utilizarlo?

Descongelarlo en hielo

¿Cuál es el propósito de la centrifugación rápida?

Remover el aire del microtubo

¿Cuántas veces se debe realizar la centrifugación rápida?

1 vez

¿Qué es necesario cerrar inmediatamente después de transferir el 'master mix'?

La tapa del microtubo

¿Cuál es el nombre del sistema de imagen utilizado en este procedimiento?

CHEMI DOC Touch Imaging System

¿Cuál es el propósito del marcador 1 kb?

Visualizar la migración de las muestras

¿Qué tipo de tintes se encuentran en el 'loading dye'?

Azul y amarillo

¿Cuál es el tamaño del producto específico amplificado 16S rDNA?

1.5 kb

¿Cuál es el propósito de identificar los carriles con la muestra correspondiente?

organizar las muestras en el gel

¿Qué debe incluir la oración inicial en la parte inferior de la figura?

El porcentaje de agarosa utilizada y la muestra trabajada

¿Cuál es el resultado de que el 'primer' 'forward' y 'reverse' tengan secuencias de bases complementarias entre sí?

La formación de productos no específicos

¿Qué debe hacerse con los controles negativos en la figura?

Agruparlos con los grupos experimentales

¿Cuál es el propósito de la Figura?

Visualizar la migración de las muestras

¿Cuál es el tamaño del marcador que se utiliza en el experimento?

1 kb

Study Notes

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

  • La PCR es una técnica que permite amplificar una secuencia específica de DNA en una muestra utilizando ciclos repetitivos de temperatura.
  • La técnica se puede utilizar para la detección de patógenos bacteriales o virales como HIV y COVID 19.
  • La PCR también se utiliza en la detección de mutaciones en genes asociados a enfermedades como fibrosis quística, anemia falciforme, cáncer, entre otras.
  • La técnica permite identificar individuos en casos criminales, paternidad e identificación de cadáveres o restos humanos en casos de grandes catástrofes.

Componentes necesarios para la PCR

  • DNA de doble hebra (dsDNA) con la secuencia específica que se quiere amplificar.
  • "Primer" forward y reverse, oligonucleótidos sintéticos, cortos y flanquean el gen que se quiere amplificar.
  • Desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
  • DNA polimerasa, como Taq polimerasa, aislada de la bacteria Thermus aquaticus.
  • Buffer de Taq polimerasa o Tth, necesario para que la enzima pueda trabajar en forma óptima.
  • MgCl2, cofactor necesario para que la DNA polimerasa pueda sintetizar DNA en forma óptima.

Pasos de amplificación

  • Etapa 1: Desnaturalización inicial (94-97°C) para asegurar la separación de la doble hebra de DNA.
  • Etapa 2: 30X ciclos de desnaturalización (94-97°C), alineamiento (47-60°C) y extensión (72°C).
  • Etapa 3: Extensión final (72°C) para completar la síntesis de las nuevas hebras de DNA.

Electroforesis en gel de agarosa

  • Permite determinar la presencia del producto específico, productos no específicos y contaminación de DNA exógeno.
  • Se utiliza un marcador de 1 kb y se visualizan las bandas en el gel.

Protocolo de PCR

  • Preparar el master mix con el Go Taq Green Master Mix, agua, primers forward y reverse, y DNA genomico.
  • Realizar una centrifugación rápida y transferir el master mix a cada microtubo de PCR.
  • Realizar los ciclos de PCR en un Thermal Cycler.

Resultados y discusión

  • Se analiza el gel de agarosa y se identifican las bandas correspondientes al producto específico, productos no específicos y contaminación de DNA exógeno.
  • Se discuten los resultados en relación con la presencia del gen 16S rDNA en la bacteria Escherichia coli.

This quiz will assess your understanding of the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique and its applications, as well as the characteristics of the 16S rDNA gene. You will also be tested on your ability to amplify the 16S rDNA gene from the genome of Escherichia coli.

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