PCR classique vs PCR en temps réel

Introduction à la PCR

• La technique PCR permet de repérer un gène spécifique dans l'ensemble d'un génome.
• Il est difficile d'identifier un gène particulier dans un génome entier car il en contient des centaines de milliers.

Définition de la PCR

• PCR signifie Polymerase Chain Reaction.
• En français, le terme équivalent est Amplification en Chaîne par Polymérisation (ACP), mais il est rarement utilisé. Elle permet de copier en grand nombre une séquence ADN/ARN connue, en la multipliant par un facteur de l'ordre du milliard, à partir d'une faible quantité d'acide nucléique.
• Elle est utile pour la purification ou le clonage.

Histoire de la PCR

• En 1983, le Dr. Kary Mullis a développé la PCR.
• En 1985, la première publication de la technologie PCR a été faite par la Cetus Corporation.
• En 1993, le Dr Kary Mullis a reçu le prix Nobel de chimie pour avoir conçu la technologie PCR.
• Elle a révolutionné de nombreux domaines de la recherche génétique. Elle a bouleversé la biologie moléculaire et s'est rapidement implantée dans les laboratoires.

Principe de travail de la PCR

• Elle consiste à réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN qui se répètent en boucle, comportant chacun trois paliers de température. Chacun de ces paliers est caractérisé par une réaction chimique distincte. Elle utilise les produits de chaque étape de synthèse comme matrices pour les étapes suivantes, au lieu de les séparer, afin de ne réutiliser que la matrice originale, ce qui donne une amplification exponentielle au lieu d'une amplification linéaire.
• En moyenne, une PCR comporte entre 20 et 40 cycles.
• Chaque cycle est composé de 3 étapes.

Les étapes de la réaction PCR

• Il y'a trois étapes:
  • Dénaturer l'ADN pour obtenir des matrices simple brin.
  • Borner et amorcer la réplication de la séquence.
  • Réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire.

Les températures d'une PCR

• Le contrôle de l'activité enzymatique se fait à des températures différentes:
  • L'étape de dénaturation se déroule à environ 95°C.
  • L'étape d'hybridation se fait à une température qui varie de 50 à 60°C selon la nature des amorces.
  • L'étape de polymérisation se déroule à environ 72°C.
• Les températures de dénaturation et de polymérisation sont fixes, seule la température d'hybridation doit être calculée pour chaque nouvelle PCR.
• La température d'hybridation dépend de la composition en bases des oligonucleotides amorces.

Milieux réactionnels

• dNTP
• Magnésium
• ADN polymérase
• Deux types d'amorces
• On ajoute ensuite l'ADN extrait du milieu biologique à étudier au mix.

Optimisation de la PCR

• Les composants de la réaction et leur influence sur l'amplification sont:
  • L'enzyme ADN polymérase thermostable
  • La température de fusion
  • Les agents chimiques
  • Les amorces sens et anti sens
  • le magnésium
• Ces deux derniers composants définissent un milieu avec un pH optimal et une concentration saline optimale pour le bon fonctionnement de l'enzyme.

Conditions des amorces à utiliser

• Le choix des amorces est crucial lors d'une PCR. Elles vont avoir un double rôle:
  • En s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d'ADN a amplifier et avec leurs extrémité 3'OH libres, servir d'amorce pour l'ADN polymérase
• Elles sont obtenues grâce à la synthèse chimique d'ADN, ce qui permet d'obtenir des oligonucleotides dont l'extrémité 5' n'est pas phosphorylée contrairement aux ADN "dits" naturels

Amorces sens et anti-sens

• Des logiciels permettent de définir rapidement des amorces dans une séquence donné (Primer 3').
• Taille idéale de 20 - 30 nucléotides
• Les amorces doivent être exactement complémentaires du fragment a amplifier.
• Les séquences des deux amorces du même couple doivent présenter le maximum de divergence, particulièrement a l'extrémité 3' pour éviter l'hybridation.
• Il faut éviter la présence d'auto complémentarité (hybridation de l'amorce sur elle-même)
• Il devraient avoir une composition de base riche à 50%-60% GC, et des Tms équivalents (1°).
• Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C) x 4 °C]
• Formule approximative, valable pour des amorces inférieurs à 25 nucléotides

ADN Polumérase Thermostable

• Actuellement la Taq polymérase est utilisée -> << Eubactéries >> extraite de bactérie (thermusaquaticus) vivant dans les sources chaudes.
• Sa T° optimale = 72° (70 - 75°)
• Capable de résister à de fortes T° ce qui a permis l'automatisation de la procédure.
• La quantité d'enzyme: 0,2-0,5... 1U (risque de bandes parasites, si la quantité est importante)
• Pas d'activité exonucléasique 3' - 5'

Magnésium

• Valeur comprise entre 1.5 mM et 2 mM le Mg2+
• Influence l'activité de l'enzyme, augmente la stabilisation du double brin et élève le Tm -Pour optimiser une PCR il est nécessaire de faire une gamme de MgCl2.

DésOxyribonucléotides-TriPhosphates

• Les dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont des molécules de base, qui constituent l'ADN utilisés par Taq polymérase pour la synthèse du nouveau brin d'ADN complémentaire.

ADN Matriciel

• Avant la réaction de PCR, ADN est extrait à partir de l'échantillon que l'on analyse (salive, cheveux, cellules, fossile).
• Puis, cet extrait purifié en ADN, contenant le fragment d'ADN que l'on souhaite amplifier, peut être utilisé en PCR.
• En théorie une copie ADN de la séquence recherchée est suffisante.
• En pratique, plusieurs copies sont nécessaires pour un résultat correct, sans quantité trop importante car cela peut conduire à une amplification aspécifique.

Agents Chimiques

• Le DMSO (2-10%) (sulfoxyde diméthylique) aide souvent l'amplification de fragments de +1 kb
• La formamide (1-5%) peut apparemment améliorer la spécificité de la PCR et diminue les amplifications parasites
• Le Glycérol (2%-10%) améliore l'amplification des échantillons élevés (GC) et protège la Taq contre dégradation par chaleur.
• Le polyéthylène Glycol 6000 (5-15%) peut être un additif utile quand la concentration de l'échantillon d'ADN est très basse et améliore l'efficacité d'amplification.

Thermocycleur

• Sert à effectuer les transitions de températures
• Les mircrotubes contenant le mélange réactionnels sont placés
• Le thermocycleur est l'appareil programmable.
• L'appareil permet d'exposer les tubes à des températures choisies et pour une durée déterminée par l'expérimentateur La réaction PCR est extrement rapide et ne dure que quelques heures à la fois (2 à 3h pour une PCR de 30 cycles)

La réaction de la PCR

• Une PCR classique se déroule dans un petit tube, placé dans un thermocycleur
• Tous les << acteurs >> de la PCR sont introduits dans le tube: -ADN à amplifier, des oligonucléotides/amorces spécifiques du segment d'ADN voulue, Taq polyermerase et le mélange des quatre désoxyribonucléotides constituants de l'ADN
• Le tout est ajouté en large excès par rapport à l'ADN
• Le premier cycle commence avec ses trois (3) étapes

La dénaturation

• La température dans le tube est réglée à 95° C
• À cette température, les liaisons qui assurent la cohésion de la double hélice d'ADN sont rompues -> Donne deux simples brins, donc la dénaturation a lieu

L'Hybridation

• La température est descendue a dite température d'hybridation Cette dernière est généralement comprise entre 50°C et 60°C, et elle est fonction de la composition des désoxyribonucléotides
• Les amorces reconnaissent et se fixent à leurs séquences complémentaires en reformant des liaisons hydrogènes

L'élongation

• Puis, la température est réglée à 72° C, température idéale pour l'activité de la Taq Polermerase
• Les amorces Hybridées à l'ADN servant de point de départ à la polermisation du brin d'ADN et à l'ADN matrice
• La polermisation se fait par l'ajout successif des désoxyribonucléotides
• Les base ajoutée est complémentaire de la base correspondant au brin matrice)
• Mais la polermisation ne s'arrête pas lorsque la copie est de longueur souhaitée. la copie d'ADN initiale génère des copies plus longes que souhaitait

Etapes Suivantes de la réaction

• Lors des étapes suivantes, les nouveaux fragments synthétisés servent à leurs tour de matrice pour synthétiser de Nouveaux fragments d'ADN
• En théorie, à la fin de chaque cycle la quantité d'ADN cible est doublée
• À partir d'une copie d'ADN Cible, on pourra donc obtenir un milliard (10^9) de copie d'ADN Cible

Applications de la PCR

• Biologie Moléculaire.

  • Travaux de recherches fondamentale et de multiples applications routinières.

• Médecine.

  • Diagnostiquer des maladies génétiques
  • Diagnostique des maladies infectieuses, infections virales, infections bactériennes
  • Anomalies génétiques, différentes mutations dans le cancer

• Agroalimentaire.

  • Pour identifier des variétés ou espèces végétales et animales
  • Pour la sélection de nouvelles variétés de fruits et légumes telles que la tomates
  • Qualité du contrôle des produits agro alimentaires
  • Détecter la présence d'OGM dans un aliment

• En Médecine Légale.

  • Identifier un personne par son empreinte génétique dans le cadre d'une d'une enquête judiciaire
  • Test de paternité

• En Histoire.

  • Pour des études phylogénétiques
  • Découvrir des liens de parenté en les individus
  • Étude des migrations des populations humaines et animales.

Avantages et des Avantages de la PCR

• Avantages*
• Peut travailler sur une petite quantité
• Travailler sur de ADN dégradé
• Pouvoir discriminer entre différentes cibles
• Désavantages*
• Problème de contamination
• Problème de la présence d'inhibitors

Les Variantes de la PCR

Le PCR quantitative (ou QPCR), ou PCR et Temps Réel: La PCR et Temps Réel (réal time PCR) est une révolution.

• Basée sur un détecteur de rapporteur fluorescent
• Signal de Fluorescence, agent SE lié à l'AND double brin

Principe de PCR en Temps Réel

• Amplification et détecteur synchronisé
• Système fermé, pas de manipulations ou d'altérations et risque faible de contamination
• Génération de Fluorescent

PCR en Temps Réel- Appareil Utilisée

• Se réalise dans un thermocycleur rapide couplé à un spectroflourimitre pour déterminer la quantification et le profil thermiques exactes.
• Amplification d'un segment d'ADN suivi en temps réelle par le mesure de la signal émise chaque cycle
• LighCycler
• Roche et utilisé

Explication de Cycle dans PCR en Temps Réel

• Lors dénaturaion Les deux brins se séparent
• La sonde et le couple d'amorces s'hybrident au ADN cible pour une une liaison spécifique
• Lors de polymérisations le sonde s'hydrolyse et dégage le fluorochorme qui émet un signal

Courbe de Fluorescent et Ligne De Base

Cycle seuil. Ct ou Cp: Est un cycle de intersection de la COURBE PCR aves est

• directement liée à la quantité de cible dans l'échantillon
• le nombre de cycles d'amplifcation necéssaire poir obtenir un signale fluroescent statistique significative par rapport au brut de fond (valeur seuil)

Cycle threshold: is used for quantitative mesures et se trouve en phase logarithin de d'amplification Ct est lie a un détection de un niveau de flourorescene, se définit the "seuil(threshold)" C'est le nombre de cycle qui se faut à la réaCTION POUT D'ATtEINDRE UN SEUIL DONNÉE

La RT-PCR

• la RT PCR reverse TRanscriptase PCR est une technique qui associante une Transcription une transcription inverse (RT) suivit d'une PCR
• PermET De Synthétiser le Brin complémentaire d'un ARN Avec des désotyribonucléotides en itulisant une ADN polmerrase ADN dépendante (transcritase Inverse)
• RT- PCR se déroule en duex Phases:
  • Une premiere phase correspondent a une Copie d'ARN un MDN Complentaire (ADNc) et seconde phase corresponds une Reaction PCR classique sue de ADN synthétiser Dans la première phase, l'ARN messager à étudier est réperée en utilisant SONDE, puis, La transcriptée inverse (rétromélange) Cequi permet Synthése
• Note*. 70 % déstabilisation structure Second Il Net FAut Sortout Pass confondres Avée le Ensuite la technique RT-PCR a permis de montrer que transcription de tours let genes effecterant déans tour les tissus et Ceci Memé la toux les gènes pas tout grandes spécifique et Tissulaire

Ce quiz explore les différences entre PCR classique et PCR en temps réel, en mettant l'accent sur la détection des produits d'amplification et les avantages de la PCR en temps réel. Il aborde également la génération de signaux fluorescents et le rôle du spectrofluorimètre.