T13 Microscopio Electrónico: Fundamentos

Generalidades del Microscopio Electrónico

• El microscopio electrónico fue inventado a principios del siglo XX
• Se mejoró en los años 30, dando lugar a la producción de los microscopios electrónicos de transmisión y barrido
• A diferencia del microscopio óptico, ofrece mayor aumento por el uso de electrones en lugar de luz visible
• Está compuesto por una fuente de electrones, lentes electromagnéticas, cámara de vacío y detector o pantalla fluorescente
• La fuente de electrones es un hilo de wolframio que, al calentarse, aumenta la energía de los electrones
• Las lentes electromagnéticas producen campos eléctricos y magnéticos, permitiendo a los electrones converger o divergir
• Estas lentes presentan aberraciones como curvatura de campo, astigmatismo, distorsión de la imagen o aberración cromática y esférica
• La cámara de vacío es necesaria para que los electrones sigan su trayectoria hasta la muestra
• Las bombas mecánicas extraen el aire del interior de la cámara
• La pantalla fluorescente capta el flujo de electrones y está vinculada a un ordenador que recopila la información y muestra la imagen

Poder de Resolución

• El poder de resolución es la capacidad de distinguir dos puntos muy cercanos entre sí
• La resolución del ojo humano es de 0,1 milímetros
• Resolución es la distancia mínima medible entre dos puntos para ser distinguidos por separado
• El haz de electrones atraviesa la lente con una apertura semiangular, construyendo una imagen difusa llamada disco de Airy
• Este proceso se debe al efecto de difracción que sigue la ley de Bragg
• La ley de Bragg permite conocer en qué ángulos son difractados el haz de electrones
• Como propuso Rayleigh, dos objetos se distinguen cuando el máximo de intensidad del disco de Airy coincide con el primer mínimo del segundo disco
• El límite de resolución se distingue como la mitad de una distancia D (D₁/₂)
• Las distancias más pequeñas de D₁/₂ se observan de manera difusa

Tipos de Microscopios Electrónicos

• Existen microscopios electrónicos simples y compuestos
• Los simples incluyen el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM)
• Los compuestos incluyen el microscopio protónico, el microscopio de excitación y el microscopio iónico

Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)

• Permite observar estructuras biológicas y no biológicas a escalas muy pequeñas
• Es imprescindible que la muestra de estudio sea muy fina para que el haz de electrones la atraviese
• Permite observar las estructuras internas de las muestras, denominadas especímenes
• La platina permite el movimiento de la muestra perpendicular al eje del microscopio y es extraíble para introducir una rejilla de cobre
• La columna permite el paso de los electrones hacia la muestra y contiene un sistema de bombas mecánicas para crear vacío
• El sistema óptico está constituido por el condensador, la lente objetivo y la lente proyectora
• También cuenta con pantalla y cámara fotográfica

Procedimiento para Visualizar un Tejido en TEM

• Fijación mediante tetraóxido de osmio (OsO4) y glutaraldehído
• Contraste, utilizando OsO4
• Deshidratación de la muestra
• Inclusión de la muestra deshidratada en óxido de propileno o resinas acrílicas
• Corte mediante el uso del ultramicrotomo (de 100 nm)
• Visualización de la muestra y captura mediante micrografías

Aplicaciones del TEM

• Se utiliza en investigaciones biológicas y biomédicas
• Es una herramienta imprescindible en los laboratorios patológicos
• Se usa en el sector metalúrgico y de la cristalografía, sobre todo en el estudio de materiales semiconductores
• Algunas aplicaciones comunes son petrología, mineralogía, estudios de la estructura celular, virología y citoquímica
• Permite investigar enfermedades microbianas identificando virus, bacterias, parásitos y hongos
• Permite analizar muestras clínicas como orina, sangre, heces y biopsias

Microscopio Electrónico de Barrido (SEM)

• El haz de electrones incide sobre la superficie de la muestra, sin atravesarla, mediante un escaneo
• Visualiza la estructura tridimensional y/o topográfica de la muestra
• Sus componentes son similares al TEM, incluyendo sistema de vacío, filamento que emite los electrones y lentes electromagnéticas
• Cuenta con un dispositivo de escaneo que se desplaza por la superficie de la muestra, y un detector de electrones secundarios

Procedimiento para Visualizar un Tejido en SEM

• Fijación de la muestra
• Deshidratación de la muestra sustituyendo el agua por disolventes orgánicos y un fluido de transición (CO2 líquido)
• No se realiza corte
• El contraste se realiza con grafito u oro
• Visualización y captura mediante micrografías

Aplicaciones del SEM

• Se utiliza para multitud de estudios, desde la industria petroquímica hasta la medicina forense
• Permite estudiar la morfología y estructura de minerales, cristales y piedras en geología
• Permite estudiar el esmalte dental en odontología, observando los microorganismos de las superficies vestibulares
• Se utiliza para el control y calidad de productos de uso y consumo
• Útil en la industria textil para el análisis de fibras
• En medicina forense, es útil en el estudio morfológico de pruebas
• En el ámbito de la biología celular, permite observar la morfología de células y tejidos animales

Microanálisis (AEM)

• También conocido como microscopía electrónica analítica
• Utiliza tanto la técnica del microscopio electrónico de transmisión como el microscopio electrónico de barrido
• Requiere bobinas para escanear la muestra y un dispositivo que captura la emisión de rayos X
• Se utiliza la espectroscopia de dispersión de energía de rayos X (EDX) y la espectroscopia por pérdida de energía de los electrones (EELS)
• Incluye otras técnicas como la catodoluminiscencia y la espectroscopia de Auger

Espectroscopia de Auger

• Técnica analítica que se basa en el proceso de emisión de electrones secundarios tras la desaparición de los electrones primarios de un átomo
• Es más utilizada que la espectroscopia de dispersión de energía de rayos X, sobre todo en el estudio de muestras con un número atómico bajo

Catodoluminiscencia

• Consiste en la emisión de fotones de una muestra bombardeada por electrones
• Elimina el exceso de energía generada por los electrones entre los orbitales
• Se utiliza para el estudio de las impurezas de un material

Microscopía Electrónica de Transmisión de Barrido (STEM)

• Utiliza un haz de electrones como el microscopio electrónico de transmisión
• Identifica señales como los electrones secundarios, electrones dispersados del haz, rayos X y pérdida de energía de electrones
• Utiliza dos sistemas para generar la imagen: campo claro y campo oscuro

Imágenes Formadas con STEM

• Una imagen de STEM en campo claro suele caracterizarse por poseer una baja resolución, un alto contraste y ruido
• Una imagen de STEM en campo oscuro posee menos ruido, pero menor resolución

Aberraciones en Microscopía Electrónica

• Los problemas producidos con el uso del microscopio electrónico son similares a los del microscopio óptico
• Se deben a las desviaciones en el enfoque de una imagen debido a las imperfecciones de la lente o al déficit de uniformidad del haz electrónico
• Las aberraciones esféricas son la incapacidad de una lente para focalizar el haz de luz o de electrones
• Las aberraciones cromáticas son provocadas por las diferentes energías emitidas por los electrones, dando lugar a una imagen borrosa
• El astigmatismo es producido por una asimetría en el campo magnético de la lente

Resumen

• El microscopio electrónico mejoró el aumento y la resolución de las imágenes gracias a lentes electromagnéticas y fuente de electrones
• El microscopio electrónico de transmisión TEM permite observar a través de la muestra con cortes finos
• El microscopio electrónico de barrido o SEM permite observar la superficie de una muestra sólida
• La microscopía electrónica de transmisión de barridos STEM combina los modelos anteriores
• Al igual que el microscopio óptico, existen problemas con la observación de las imágenes, como las aberraciones y el astigmatismo
• El microscopio iónico también denominado haz de iones enfocados (FIB) utiliza un haz de iones, concretamente de galio, en vez de electrones
• Es utilizado en la industria de los semiconductores y en el área de la biología