Microscopía Óptica Convencional

Microscopía óptica convencional

• Luz: según el modelo ondulatorio, es una onda electromagnética con longitud de onda, amplitud y frecuencia. Según el modelo corpuscular, está compuesta de fotones, partículas sin masa.
• Espectro visible: se encuentra entre 400 y 700 nanómetros (nm).
• Reflexión: cambio de dirección de la luz al chocar con una superficie (especular o difusa).
• Refracción: cambio de velocidad y dirección de la luz al pasar de un medio a otro. El índice de refracción afecta a este cambio.
• Índice de refracción (n): relación entre la velocidad de la luz en el vacío y su velocidad en el medio. (n = c/v , donde c es la velocidad de la luz en el vacío, y v la velocidad de la luz en el medio).
• Ley de Snell: describe la relación entre los ángulos de incidencia y refracción de la luz cuando pasa de un medio a otro. (n₁senθ₁ = n₂senθ₂)
• Ángulo crítico: ángulo de incidencia a partir del cual la luz no se refracta, sino que se refleja totalmente.

Microscopía óptica no convencional

• Campo oscuro: se bloquea la luz directa para observar solo la luz dispersada por la muestra, lo que permite visualizar objetos transparentes en un fondo oscuro.
• Contraste de fases: se aprovecha el ligero desfase de la luz que atraviesa la muestra para generar un contraste visible.
• Interferencial diferencial: usa la diferencia en los desfases de la luz que atraviesa la muestra para crear imágenes con mayor detalle de las estructuras.
• Luz polarizada: se utiliza un filtro polarizador para observar la estructuras con propiedades ópticas anisótropicas.

Microscopía de fluorescencia

• Fotoluminiscencia: fenómeno donde la materia absorbe luz y emite a su vez luz, esta puede ser fosforescencia o fluorescencia.
• Fluorescencia: la emisión de luz cesa al cesar la absorción de luz incidente.
• Ley de Stokes: la longitud de onda de la luz emitida es mayor que la de la luz incidente. La energía de la luz emitida (fluorescencia) es siempre menor que la de la luz incidente.
• Fluoróforos: sustancias que absorben luz y emiten luz.
• Espectro de absorción: gráfica que muestra la absorbancia de un fluoróforo a diferentes longitudes de onda.
• Espectro de emisión: gráfica que muestra la intensidad de la fluorescencia emitida a diferentes longitudes de onda.
• Stokes Shift: diferencia de energía entre el pico máximo de absorción y el pico máximo de emisión.

Microscopía electrónica de transmisión

• Electrones: partículas con carga negativa que se aceleran mediante una diferencia de potencial. A mayor voltaje, menor longitud de onda.
• Límite de resolución: el poder de resolución del M.E. es del orden de 0,1 nm en la práctica, esto es debido a la apertura numérica de las lentes.
• Mecanismo de formación de la imagen: los electrones son desviados al atravesar la muestra. La desviación depende del número atómico del material, dónde la imagen resultante mostrará mayor oscuridad en elementos con alto nº atómico.
• Preparación de muestras: requerimiento de cortes ultrafinos (30-100 nm de grosor).

Microscopía electrónica de barrido

• Haz de electrones: los electrones son dispersados por la muestra, provocando que la muestra emita electrones secundarios y rayos X.
• Detectores: varios tipos de detectores permiten la obtener tres tipos de imágenes: electrones secundarios, electrones retrodispersados y rayos X.
• Mecanismo de formación de la imagen: no se requiere corte ultra fino y se obtiene información superficial.
• Preparación de muestras: no requiere cortes ultrafinos.

Técnicas de marcaje inmunocitoquímico

• Anticuerpos → proteínas que se unen específicamente a antígenos.
• Tipos: policlonales (varios anticuerpos diferentes) y monoclonales (único anticuerpo).
• Técnicas: Directas (el anticuerpo se une a un marcador) e indirectas (un anticuerpo secundario reacciona con uno primario marcado).
• Detección: fluorocromos, enzimas, metales electrodensos.

Técnicas de marcaje histoquímico

• Métodos → basados en reacciones químicas entre componentes de interés en el tejido y reactivos de tinción, generando un producto coloreado e insoluble.
• Detección de grupos químicos: con moléculas específicas para grupos químicos.
• Detección de enzimas: con sustratos artificiales que los enzimas reaccionan con ellos.
• Detección de iones metálicos: mediante reacciones químicas.

Citometría de flujo

• Principio de Coulter: mide el tamaño y la complejidad de las células basándose en la medida de la perturbación eléctrica producida al pasar por un haz de luz.
• Señales: forward scatter (FSC): tamaño celular, side scatter (SSC): complejidad celular, fluorescencia, la fluorescencia suele corresponder a marcadores específicos unidos a las células.
• Análisis de datos: proporciona diagramas unidimensionales (histogramas), bidimensionales (diagramas de puntos) y multidimensionales.

Técnicas de marcaje autorradiográfico

• Isótopos radiactivos: elementos que se desintegran y emiten radiación.
• Autorradiografía: usa una película fotográfica para detectar los isótopos radiactivos marcados.
• Fluorografía: usa una pantalla fluorescente para detectar la radiactividad y obtener la imagen.
• Phosphorimaging: utiliza pantallas sensibles que se miden tras la exposición.

Hibridación in situ (FISH).

• Detección de fragmentos específicos de ácidos nucleicos.
• Se usa una sonda complementaria marcada.
• Identificación de la localización de fragmentos de ADN específicos dentro de células o tejidos.

Técnicas de marcaje inmunohistoquímico

• Identifica localizaciones subcelulares de antígenos, se puede usar para cuantificar y localizar la presencia.

Este cuestionario explora los conceptos básicos de la microscopía óptica, incluyendo el comportamiento de la luz, el espectro visible, y los principios de reflexión y refracción. Aprenderás sobre la ley de Snell y el índice de refracción, así como el ángulo crítico de incidencia. Ideal para aquellos que estudian óptica y microscopía.