Metodi di Estrazione del DNA e Elettroforesi

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Questions and Answers

Quale metodo di estrazione del DNA è più adatto per purificare piccole quantità di DNA?

Qualsiasi metodo è adatto per piccole quantità di DNA

Estrazione non organica con proteinasi K e Sali

Estrazione con fenolo-cloroformio-alcol isoamilico (correct)

Estrazione con colonne

Qual è il ruolo dell'etanolo freddo/isopropanolo nell'estrazione del DNA con metodo fenolo-cloroformio?

Rimuovere i lipidi

Rompere le membrane cellulari

Favorire la precipitazione del DNA (correct)

Digerire le proteine

Quale componente chimica è presente nel lysis buffer utilizzato nell'estrazione non organica con proteinasi K e Sali?

Fenolo

Detergenti (correct)

Alcol isoamilico

Cloroformio

Quale è la funzione dell'EDTA nel lysis buffer?

Inibire le nucleasi (C) Signup and view all the answers

Quale è il ruolo dei sali caotropici nell'estrazione con colonne?

Rendere il DNA più affine alla silice (D) Signup and view all the answers

Quale dei seguenti metodi di estrazione del DNA è il più rapido?

Estrazione con colonne (A) Signup and view all the answers

Quale metodo di estrazione del DNA è il più adatto per grandi quantità di campioni?

Estrazione con colonne (C) Signup and view all the answers

Quale metodo di estrazione del DNA è il più sicuro per l'operatore?

Estrazione con colonne (D) Signup and view all the answers

Quale dei seguenti metodi di estrazione del DNA non prevede l'utilizzo di enzimi?

Estrazione con fenolo-cloroformio-alcol isoamilico (B) Signup and view all the answers

Durante l'elettroforesi, la velocità di migrazione di una molecola è direttamente proporzionale a:

Il campo elettrico applicato (B) Signup and view all the answers

Quale tra le seguenti affermazioni riguardo l'anodo e il catodo in una cella elettroforetica è corretta?

L'anodo è positivo e il catodo è negativo. (A) Signup and view all the answers

In un'elettroforesi su gel, quale dei seguenti fattori influenza la migrazione delle molecole?

Tutti i precedenti (D) Signup and view all the answers

Quale è la funzione dell'alimentatore in un sistema elettroforetico?

Convertire la corrente da alternata a continua e mantenere costante la tensione o l'intensità di corrente (D) Signup and view all the answers

Quale tipo di corrente viene utilizzata in un'elettroforesi?

Corrente continua (A) Signup and view all the answers

Quale relazione c'è tra la concentrazione di agarosio/poliacrilammide e la migrazione delle molecole?

Minore è la concentrazione di agarosio/poliacrilammide, più veloce la migrazione (D) Signup and view all the answers

Perchè la tensione viene mantenuta costante durante l'elettroforesi?

La temperatura del tampone aumenta durante la corsa, aumentando la resistenza del supporto (D) Signup and view all the answers

Quale dei seguenti fattori NON influenza la velocità di migrazione delle molecole durante l'elettroforesi?

La pressione atmosferica (B) Signup and view all the answers

In quale direzione migrano le molecole cariche negativamente in un campo elettrico?

Verso l'anodo (A) Signup and view all the answers

Quale dei seguenti parametri può essere utilizzato per stimare la dimensione delle molecole durante l'elettroforesi?

Tutti i precedenti (B) Signup and view all the answers

Qual è il componente principale della matrice in una cella elettroforetica a sviluppo orizzontale?

Agarosio (B) Signup and view all the answers

Qual è l'effetto di un'elevata forza ionica sul profilo di migrazione delle bande durante l'elettroforesi?

Le bande si assottigliano (B) Signup and view all the answers

Quali sono i materiali che compongono il buffer di corsa in una cella elettroforetica?

Ioni conduttori e tampone (A) Signup and view all the answers

Qual è la percentuale standard di agarosio da utilizzare per un DNA di piccole dimensioni (100-300 pb)?

2% (C) Signup and view all the answers

Qual è la funzione principale del loading buffer nell'elettroforesi su gel di agarosio?

Tracciare il progresso della migrazione del campione (A) Signup and view all the answers

Qual è il primo passo nel processo di passaggio delle cellule?

Aspirare il terreno (A) Signup and view all the answers

Quale enzima viene utilizzato per separare le cellule dalla matrice extracellulare?

Tripsina (D) Signup and view all the answers

Perché è importante la temperatura di incubazione di 37 °C durante il passaggio delle cellule?

È la temperatura ottimale per l'enzima tripsina (B) Signup and view all the answers

Che ruolo hanno gli agenti chelanti come l'EDTA nel processo di passaggio delle cellule?

Rimuovono gli ioni Ca e Mg che favoriscono l'adesione (B) Signup and view all the answers

Qual è la funzione fondamentale del polistirene trattato per le piastre di coltura cellullare?

Favorisce l'adesione delle cellule (C) Signup and view all the answers

Cosa succede se le cellule sono troppo concentrate durante il passaggio?

Si verifica un'inibizione da contatto (A) Signup and view all the answers

Qual è lo scopo principale della diluizione del terreno fresco nel processo di passaggio delle cellule?

Inibire l'effetto della tripsina (C) Signup and view all the answers

Quale caratteristica deve avere un solvente ideale per essere utilizzato in spettrofotometria?

Deve essere trasparente alla lunghezza d'onda in considerazione (C) Signup and view all the answers

Quale sorgente luminosa è utilizzata per lo spettro UV?

Deuterio (B) Signup and view all the answers

A quale lunghezza d'onda assorbono le basi azotate degli acidi nucleici?

260 nm (C) Signup and view all the answers

Qual è il valore di assorbanza del DNA a doppia elica a una concentrazione di 50 µg/ml?

1 (B) Signup and view all the answers

Quale rapporto è indicativo della purezza del DNA?

A 260/280 (B) Signup and view all the answers

Qual è uno svantaggio del Nanodrop?

Non può analizzare campioni sotto 2ng/µL (A) Signup and view all the answers

Quale delle seguenti affermazioni è vera riguardo alla colorimetria?

Deve essere specifica senza interferenze (C) Signup and view all the answers

Qual è la concentrazione di RNA a singola elica corrispondente a un'assorbanza di 1?

40 µg/ml (B) Signup and view all the answers

A quale lunghezza d'onda si osservano picchi per i Sali?

230 nm (D) Signup and view all the answers

Study Notes

Introduzione alle Colture Cellulari

Una coltura cellulare è un modello in vitro, dove le cellule vengono isolate dall'organismo e coltivate per minimizzare le variazioni sistemiche nell'animale o nell'uomo.
Le cellule possono essere coltivate in adesione, sospensione o su matrice.
Le colture cellulari trovano utilizzi in diversi campi, come quello farmacologico (screening di farmaci, valutazione dell'attività proliferativa e meccanismo d'azione), tossicologico (valutazione della tossicità cellulare), cosmetico e ricerca biomedica.

Allestimento delle Colture Cellulari

Le cellule utilizzate per le colture cellulari possono provenire da tessuti con elevata proliferazione, tessuti normali con alto contenuto di cellule staminali/progenitrici (ad esempio, ematopoietico), e tessuti tumorali, oppure con scarsa attività proliferativa (tessuti connettivali, ghiandole, pancreas).

Cellule Utilizzate

Fibroblasti: cellule isolate dal tessuto connettivo, che crescono in adesione.
HeLa: cellule epiteliali isolate da un tumore cervicale, che crescono in adesione e sono la prima linea cellulare in coltura continua.
Cellule ematopoietiche: cellule tondeggianti che crescono in sospensione.

Tipi di Colture Cellulari

Coltura cellulare primaria: deriva da un espianto di tessuto o organo, e può duplicarsi per un numero limitato di passaggi.
Linea cellulare: deriva da una coltura primaria o da cellule tumorali, e si può replicare all'infinito.

Colture Cellulari Primarie

Queste colture sono composte da cellule isolate da un tessuto o organo e che si possono replicare per un numero limitato di volte.
Possono provenire da tessuti di individui adulti o embrioni, oppure da organi freschi.
Alcune cellule si moltiplicano (es. fibroblasti), altre no (es. globuli rossi, cellule nervose).

Passaggio di cellule

È un processo che permette la moltiplicazione di cellule (adese).
Coinvolge l'aspirazione del terreno di coltura, il lavaggio con un tampone, l'aggiunta di tripsina, incubazione, l'aggiunta di un agente chelante (EDTA) e ricostituzione in nuovo terreno.

Crescita Cellulare

Monostrato: cellule adese alla superficie del contenitore.
Confluenza: quando le cellule occupano tutta la superficie del contenitore.
Sospensione: le cellule crescono sospese nel terreno di coltura.

Mantenimento delle Colture Cellulari

Le colture cellulari vengono mantenute in un incubatore a 37°C con umidità e CO2 adeguate.
Il mantenere l'umidità del terreno di coltura impedisce l'aumento della pressione osmotica per evitare la lisi delle cellule.

Terreno di Coltura (Medium)

Il terreno di coltura fornisce le sostanze nutritive per le cellule.
Può essere naturale o sintetico (completo o incompleto).
Il medium incompleto necessita di aggiunta di siero, antibiotici, e altre sostanze.
Il medium completo contiene già tutto ciò che serve alle cellule.
È conservato a 4°C.

Contaminazioni delle colture

Possono essere causate da batteri, lieviti, muffe, micoplasmi.

Test di Vitalità e Citotossicità

I test di citotossicità valutano il danno cellulare causato da sostanze.
Esempi di test di citotossicità: Trypan blue, MTT e LDH.

Biobanche

Raccolgono, conservano e distribuiscono materiale biologico per la ricerca.

Altro tipo di colture cellulari

Colture d'organo o istotipiche: piccole porzioni di organo coltivate in vitro con vita breve .
Organoidi: derivano da cellule staminali o tumorali, che crescono in vitro e si auto-organizzano in struttura simili a organi.
Co-colture: sistemi contenenti due tipi di cellule diverse.

Distruzione delle cellule e tessuti

I metodi meccanici includono sonificazione, pestaggio e mortaio e uso di un omogenizzatore.
I metodi non meccanici includono l'uso di sali (shock osmotico), detergenti, freezing/thawing ed enzimi litici.

DNA

DNA plasmidico: si estrae con una cromatografia a scambio ionico.
Esistono metodi di estrazione organica, come il fenolo-cloroformio/alcool isoamilico.
Sono disponibili anche metodi non organici, che utilizzano una proteinasi K o diversi sali.

RNA

È una molecola molto fragile.
Può essere estratta mediante metodi di estrazione organica (Triszol) o inattivazione delle RNAasi ad esempio con metodi di solubilizzazione o con tamponi.

Quantificazione di Acidi Nucleici

I metodi più comuni per la quantificazione dell'RNA sono la fotometria e l'elettroforesi capillare.
Per la quantificazione del DNA è possibile utilizzare spettrofotometri UV.

Quantificazione di proteine (relativa e assoluta)

La colorimetria (saggio di Bradford, Lowry, biureto) è una delle tecniche più utilizzate per la quantificazione di proteine.
La marcatura con isotopi stabili (SILAC) e la marcatura chimica (ICAT) sono applicate in metodi di quantificazione assoluta.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

È una tecnica usata per amplificare specifiche sequenze di DNA.
I reagenti della PCR includono il DNA stampo, i primers, i nucleotidi, la DNA polimerasi e il MgCl2.
Il processo di PCR avviene in un termociclatore con cicli ripetuti di denaturazione, annealing e estensione.

Metodi per l'analisi di interazione DNA-proteina

EMSA (Eletroforesi di Mobilità del DNA) e ChIP (Immunoprecipitazione della cromatina)
La tecnica di ChIP è usata quando si vuole studiare tutte le proteine che si legano ad una parte del DNA.

Proteomica (analisi dei metaboliti)

La proteomica è lo studio completo delle proteine nel genoma di una cellula, tessuto o organo.
Esistono due metodi principali: "top-down" e "bottom-up".
"Bottom-up" più utile quando si vuole fare una mass spectrometry.

Metodi di Trasfezione

Trasfezione chimica (lipidi cationici, calcio fosfato);
Trasfezione fisica (elettroporazione).

Selezione delle cellule trasfettate

I marcatori selezionabili nei vettori sono solitamente geni che conferiscono resistenza agli antibiotici.
La GFP può essere utilizzata come marcatore visivo.

Immunoprecipitazione

La immunoprecipitazione serve per isolare proteine di interesse e studiare le loro interazioni.
È una tecnica basata sull'utilizzo di anticorpi che si legano alla proteina di interesse.
La co-immunoprecipitazione è un metodo per identificare interazioni tra proteine.

Analisi quantitativa

Le analisi quantitative della metabolomica possono essere relative (utilizzando campioni con etichette isotopiche) o assolute (utilizzando standard interni).

Single-cell RNAseq e Spatial transcriptomics

Tecniche per ottenere informazioni su singoli trascritti di una cellula specifica.
Permette di studiare diversi tipi di cellule in un tessuto, analizzando l'espressione genica di ciascuna.

Spettrometria di Massa

Utilizza una sorgente di ioni per ionizzare le molecole in fase gassosa e un analizzatore per separarle in base al rapporto massa-carica.

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Description

Questo quiz esplora vari metodi di estrazione del DNA, evidenziando le tecniche più adatte per differenti quantità di campioni e la loro sicurezza. Inoltre, vengono trattati aspetti fondamentali dell'elettroforesi, come la migrazione delle molecole e la funzione degli elementi nella cella elettroforetica.