Metodi di Estrazione del DNA e Elettroforesi

Introduzione alle Colture Cellulari

• Una coltura cellulare è un modello in vitro, dove le cellule vengono isolate dall'organismo e coltivate per minimizzare le variazioni sistemiche nell'animale o nell'uomo.
• Le cellule possono essere coltivate in adesione, sospensione o su matrice.
• Le colture cellulari trovano utilizzi in diversi campi, come quello farmacologico (screening di farmaci, valutazione dell'attività proliferativa e meccanismo d'azione), tossicologico (valutazione della tossicità cellulare), cosmetico e ricerca biomedica.

Allestimento delle Colture Cellulari

• Le cellule utilizzate per le colture cellulari possono provenire da tessuti con elevata proliferazione, tessuti normali con alto contenuto di cellule staminali/progenitrici (ad esempio, ematopoietico), e tessuti tumorali, oppure con scarsa attività proliferativa (tessuti connettivali, ghiandole, pancreas).

Cellule Utilizzate

• Fibroblasti: cellule isolate dal tessuto connettivo, che crescono in adesione.
• HeLa: cellule epiteliali isolate da un tumore cervicale, che crescono in adesione e sono la prima linea cellulare in coltura continua.
• Cellule ematopoietiche: cellule tondeggianti che crescono in sospensione.

Tipi di Colture Cellulari

• Coltura cellulare primaria: deriva da un espianto di tessuto o organo, e può duplicarsi per un numero limitato di passaggi.
• Linea cellulare: deriva da una coltura primaria o da cellule tumorali, e si può replicare all'infinito.

Colture Cellulari Primarie

• Queste colture sono composte da cellule isolate da un tessuto o organo e che si possono replicare per un numero limitato di volte.
• Possono provenire da tessuti di individui adulti o embrioni, oppure da organi freschi.
• Alcune cellule si moltiplicano (es. fibroblasti), altre no (es. globuli rossi, cellule nervose).

Passaggio di cellule

• È un processo che permette la moltiplicazione di cellule (adese).
• Coinvolge l'aspirazione del terreno di coltura, il lavaggio con un tampone, l'aggiunta di tripsina, incubazione, l'aggiunta di un agente chelante (EDTA) e ricostituzione in nuovo terreno.

Crescita Cellulare

• Monostrato: cellule adese alla superficie del contenitore.
• Confluenza: quando le cellule occupano tutta la superficie del contenitore.
• Sospensione: le cellule crescono sospese nel terreno di coltura.

Mantenimento delle Colture Cellulari

• Le colture cellulari vengono mantenute in un incubatore a 37°C con umidità e CO2 adeguate.
• Il mantenere l'umidità del terreno di coltura impedisce l'aumento della pressione osmotica per evitare la lisi delle cellule.

Terreno di Coltura (Medium)

• Il terreno di coltura fornisce le sostanze nutritive per le cellule.
• Può essere naturale o sintetico (completo o incompleto).
• Il medium incompleto necessita di aggiunta di siero, antibiotici, e altre sostanze.
• Il medium completo contiene già tutto ciò che serve alle cellule.
• È conservato a 4°C.

Contaminazioni delle colture

• Possono essere causate da batteri, lieviti, muffe, micoplasmi.

Test di Vitalità e Citotossicità

• I test di citotossicità valutano il danno cellulare causato da sostanze.
• Esempi di test di citotossicità: Trypan blue, MTT e LDH.

Biobanche

• Raccolgono, conservano e distribuiscono materiale biologico per la ricerca.

Altro tipo di colture cellulari

• Colture d'organo o istotipiche: piccole porzioni di organo coltivate in vitro con vita breve .
• Organoidi: derivano da cellule staminali o tumorali, che crescono in vitro e si auto-organizzano in struttura simili a organi.
• Co-colture: sistemi contenenti due tipi di cellule diverse.

Distruzione delle cellule e tessuti

• I metodi meccanici includono sonificazione, pestaggio e mortaio e uso di un omogenizzatore.
• I metodi non meccanici includono l'uso di sali (shock osmotico), detergenti, freezing/thawing ed enzimi litici.

DNA

• DNA plasmidico: si estrae con una cromatografia a scambio ionico.
• Esistono metodi di estrazione organica, come il fenolo-cloroformio/alcool isoamilico.
• Sono disponibili anche metodi non organici, che utilizzano una proteinasi K o diversi sali.

RNA

• È una molecola molto fragile.
• Può essere estratta mediante metodi di estrazione organica (Triszol) o inattivazione delle RNAasi ad esempio con metodi di solubilizzazione o con tamponi.

Quantificazione di Acidi Nucleici

• I metodi più comuni per la quantificazione dell'RNA sono la fotometria e l'elettroforesi capillare.
• Per la quantificazione del DNA è possibile utilizzare spettrofotometri UV.

Quantificazione di proteine (relativa e assoluta)

• La colorimetria (saggio di Bradford, Lowry, biureto) è una delle tecniche più utilizzate per la quantificazione di proteine.
• La marcatura con isotopi stabili (SILAC) e la marcatura chimica (ICAT) sono applicate in metodi di quantificazione assoluta.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

• È una tecnica usata per amplificare specifiche sequenze di DNA.
• I reagenti della PCR includono il DNA stampo, i primers, i nucleotidi, la DNA polimerasi e il MgCl2.
• Il processo di PCR avviene in un termociclatore con cicli ripetuti di denaturazione, annealing e estensione.

Metodi per l'analisi di interazione DNA-proteina

• EMSA (Eletroforesi di Mobilità del DNA) e ChIP (Immunoprecipitazione della cromatina)
• La tecnica di ChIP è usata quando si vuole studiare tutte le proteine che si legano ad una parte del DNA.

Proteomica (analisi dei metaboliti)

• La proteomica è lo studio completo delle proteine nel genoma di una cellula, tessuto o organo.
• Esistono due metodi principali: "top-down" e "bottom-up".
• "Bottom-up" più utile quando si vuole fare una mass spectrometry.

Metodi di Trasfezione

• Trasfezione chimica (lipidi cationici, calcio fosfato);
• Trasfezione fisica (elettroporazione).

Selezione delle cellule trasfettate

• I marcatori selezionabili nei vettori sono solitamente geni che conferiscono resistenza agli antibiotici.
• La GFP può essere utilizzata come marcatore visivo.

Immunoprecipitazione

• La immunoprecipitazione serve per isolare proteine di interesse e studiare le loro interazioni.
• È una tecnica basata sull'utilizzo di anticorpi che si legano alla proteina di interesse.
• La co-immunoprecipitazione è un metodo per identificare interazioni tra proteine.

Analisi quantitativa

• Le analisi quantitative della metabolomica possono essere relative (utilizzando campioni con etichette isotopiche) o assolute (utilizzando standard interni).

Single-cell RNAseq e Spatial transcriptomics

• Tecniche per ottenere informazioni su singoli trascritti di una cellula specifica.
• Permette di studiare diversi tipi di cellule in un tessuto, analizzando l'espressione genica di ciascuna.

Spettrometria di Massa

• Utilizza una sorgente di ioni per ionizzare le molecole in fase gassosa e un analizzatore per separarle in base al rapporto massa-carica.