Méthodes de culture cellulaire

Culture cellulaire et applications biotechnologiques - Cours L3

• La culture cellulaire est un ensemble de techniques permettant de faire croître des cellules en dehors de leur organisme (ex vivo) ou de leur milieu d'origine, dans un but d'expérimentation scientifique.
• La culture des cellules animales fournit un système expérimental plus simple qu'un animal entier et permet d'étudier des conditions soigneusement contrôlées.
• La culture cellulaire est un outil majeur dans les sciences de la vie.
• La culture de cellules animales fait partie d'une technologie élargie nommée «La culture de tissu», qui elle-même est constituée de 3 parties essentielles:
  • Culture d'organes: Maintien d'organes en dehors de l'organisme, conservant leur structure et fonction.
  • Culture de tissus: Maintien de tissus en dehors de l'organisme, conservant les fonctions spécifiques de chaque tissu.
  • Culture cellulaire: Maintien de cellules non organisées en tissu, capables de se diviser et d'exprimer in vitro leurs métabolismes et fonctions spécifiques.
• Les applications de la culture cellulaire incluent:
  • Biologie cellulaire: Étude de la différenciation, du vieillissement cellulaire, de l'inflammation et des mécanismes du cancer.
  • Santé: Diagnostic de maladies, test de molécules thérapeutiques pharmacologiquement actives sur des cellules.
  • Biotechnologie: Production de biomolécules à usage thérapeutique (ex: insuline, interférons, cytokines, anticorps monoclonaux, vaccins).
• La méthode de culture cellulaire inclut les étapes suivantes:
  • Étude in vitro/ex vivo/in vivo.
  • Étude in vivo (avec des modèles animaux).
  • Essais cliniques (plusieurs phases).
  • Validation par la FDA et commercialisation.
  • Production des biomolécules.

Définitions clés:

• Primoculture (culture primaire): Culture dérivée de cellules prélevées directement d'un organisme vivant, sans modification génétique. Les cellules ne sont pas immortelles et dégénèrent après un certain nombre de générations.
• Repiquage/Passage: Transfert de cellules d'un flacon de culture à un ou plusieurs autres flacons. Les cellules mises en culture après le premier repiquage forment une culture secondaire.
• Lignée cellulaire: Groupe de cellules stables issues d'une seule cellule et qui se divisent indéfiniment. Elles peuvent être cancéreuses (ex: HeLa) ou rendus cancéreuses par une mutation génétique.
• Souche cellulaire: Dérivée d'une primoculture ou d'une lignée cellulaire, sélection ou clonage de cellules ayant des propriétés ou marqueurs spécifiques.
• Clone cellulaire: Population de cellules issue d'une seule cellule par division cellulaire.
• Hybridome: Cellule résultant de la fusion in vitro d'une lignée maligne de plasmocytes et de lymphocytes B provenant d'un animal préalablement immunisé.

Obtention des cellules:

• Deux types de cellules sont distingués:
  • Cellules libres (circulantes) (ex: PBMC, monocytes, lymphocytes).
  • Cellules en cohésion/adhérentes (organisées en tissus) (ex: cellules dendritiques, macrophages, hépatocytes, cellules épithéliales).
• Les méthodes d'obtention diffèrent en fonction du type cellulaire.
  • Pour les cellules circulantes, prélèvement, centrifugation et gradient de densité (Ficoll).
  • Pour les cellules organisées en tissus, dissection ou méthodes enzymatiques (ex: trypsine).

Méthodes d'obtention des cellules circulantes:

• Prélèvement sanguin/anticoagulant.
• Décantation (+4°C).
• Récupérer le plasma.
• Dilution du culot
• Tampon PBS(Phosphate Buffer Saline) pH 7,4.
• Verser délicatement le sang dilué sur le Ficoll d=1,077
• Centrifugation
• Prélever l'anneau de PBMC et procéder à un lavage par PBS-NHCl/4 puis centrifugation.
• Obtenir le culot cellulaire dans un volume minimum de RPMI-1640.

Méthodes de culture en suspension:

• Mettre les cellules (ex: PBMC) en culture en suspension dans un milieu de culture comme le RPMI-1640 à 37°C, 5% de CO2 et 100% d'humidité.
• Utiliser des incubateurs à CO2.

Culture des cellules adhérentes:

• L'adhérence à un support doit être évitée dans ce type de culture.
• Les cellules non spécifiques adhèrent sur un support qui n'est pas traité avec des molécules d'adhésion.
• Après l'incubation à 37°C, les lavages au PBS éliminent les cellules non adhérentes.
• Les monocytes adhèrent au support.
• Procédure de trypsination (enzyme: Trypsine) est nécessaire pour séparer les monocytes avec un support traité avant de les remettre en suspension dans un milieu de culture.

Test de viabilité cellulaire :

• Bleu de trypsine: Colorant vital utilisé pour distinguer les cellules vivantes (blanches au microscope) des cellules mortes (bleues).
• Test MTT: Méthode pour évaluer la viabilité cellulaire en mesurant la capacité des cellules à réduire le MTT en un produit coloré.

Méthodes de co-cultures:

• Étudie les interactions entre deux types distincts de cellules.
• Exemple: cellules dendritiques tolérogènes et lymphocytes T CD8+.

Types de culture cellulaire

• In vitro: Cultures en laboratoire (ex: lignées cellulaires).
• Ex vivo: Cultures de cellules prélevées d'un organisme vivant.
• In situ: Cultures d'explants (fragments de tissus).
• In vivo-like: Cultures 3D qui imitent l'environnement tissulaire in vivo.

Culture cellulaire 3D:

• Les cellules normales vivent dans un environnement à 3 dimensions.
• Les cultures 3D produisent une biologie cellulaire plus réaliste.

Systèmes microfluidiques (Organ-on-chip):

• Combinaison de la culture 3D et de la technologie microfluidique.
• Permet d'évaluer l'efficacité d'une thérapie cellulaire. (ex: thérapie cellulaire adoptive T cells/cancer).

Milieu de culture :

• Un milieu de culture couvre les besoins des cellules, reproduisant fidèlement l'environnement in vivo.
  • Vecteur d'éléments nutritifs.
  • Maintien des constantes physicochimiques (pH et osmolarité).
• Types de milieux synthétiques:
  • Empirique (classique): Composé de sels minéraux, métaux, glucose, acides aminés, vitamines et indicateurs de pH.
  • Définis: Composé des mêmes éléments que le milieu empirique, mais avec des quantités quantifiées précisément.

Additifs:

• Sérum: Contient des facteurs nécessaires à la division et la différenciation des cellules (hormones, facteurs de croissance, molécules d'adhésion, protéines de transport). Le pourcentage de sérum varie selon le type cellulaire.
• Antibiotiques: Inhibent la croissance des contaminants bactériens et fongiques.
• Facteurs de croissance: Molécules polypeptidiques qui régulent la prolifération, la différenciation et la survie des cellules eucaryotes.

Contrôle fonctionnel et contamination:

• Contrôle fonctionnel de la culture cellulaire: Préserver les fonctions spécifiques des cellules tout en maintenant leur prolifération.
• Critères: Conditions d'asepsie, test de viabilité, morphologie cellulaire au microscope à phase inversée, ultrastructure au microscope électronique.
• Contrôle de routine: Effectué pendant la culture, il porte sur le changement de milieu pour maintenir des conditions optimales (pH).
• Contaminations: Les agents biologiques ou chimiques peuvent altérer les caractéristiques cellulaires, il faut donc surveiller les contaminations possibles.
• Mycoplasmes: Contaminants bactériens très difficiles à détecter.
• Détection des mycoplasmes via des tests de coloration (ex: DAPI).

Conservation des cellules:

• Intérêts: Constituer une réserve, protéger des modifications génétiques, du vieillissement et contamination.
• Techniques:
  • Cryoconservation: Conservation à basses températures (-180 °C à -196 °C). Utilise de l'azote liquide.
  • Cryoprotecteurs: Substances qui préservent les cellules des dommages lors de la congélation et décongélation (ex: DMSO, glycérol).
  • Matériel: Ampoules et cryotubes.
  • Méthode de congélation progressive et décongélation rapide.

Incidences d'une mauvaise congélation/décongélation:

• Formation de cristaux de glace.
• Variation de la pression osmotique.
• Diminution du rendement cellulaire.

Testez vos connaissances sur les méthodes utilisées pour isoler et cultiver les cellules organisées en tissu. Ce quiz couvre les principes de base des techniques de culture cellulaire, du test de viabilité à l'utilisation de PBS. Parfait pour les étudiants en biologie cellulaire ou en biotechnologie.