Introduction à la biologie cellulaire

• Biologie cellulaire: Actualisation, Fiche de cours nº1 / Introduction à la biologie cellulaire, Méthodes d'études en biologie cellulaire

La vie sur Terre

• Il y a entre 10 et 100 millions d'espèces vivantes.
• Seulement 10% des espèces sont découvertes. Chaque année, environ 10 000 à 20 000 espèces sont découvertes.
• L'activité humaine accélère la disparition naturelle des espèces.
• Les espèces ont des relations entre elles et vivent ensemble, ce qui a un impact sur les écosystèmes.
• L'être humain fait partie de ces écosystèmes, et leur perturbation pourrait provoquer le fait que l'Homme ne puisse plus vivre sur Terre.
• L'origine de la vie est estimée à environ -3,5 et 4 milliards d'années à partir des fossiles de cellules primitives.
• Les organismes se reproduisent à partir d'un parent.
• L'hérédité est la transmission de caractères à la descendance lors de la multiplication d'un organisme.
• On trouve des êtres unicellulaires et pluricellulaires sur Terre. La plus grande partie des organismes sont unicellulaires.
• Tous les organismes ont une organisation commune : la cellule.

Support de l'hérédité : ADN

• Toutes les formes de vie utilisent le même code héréditaire, l'ADN ou le génome.
• Le code est à 4 lettres avec A, T, G et C.
• Chaque triplet code le même acide aminé quel que soit l'être vivant. Il est ainsi possible d'interpréter l'ADN d'une autre cellule.
• Lors de la réplication, le génome complet est recréé dans la cellule fille via un mécanisme très fidèle.
• La réplication de l'ADN est semi-conservative, extrêmement précise et fidèle
• Il y a peu de mutations. L'ADN est une molécule stable, ayant un rôle de conservation.
• Un seul brin transmis à la cellule fille, puis néo-synthèse du brin complémentaire.
• Les protéines sont synthétisées à partir de l'ADN de la cellule, via de l'ARN messager.
• L'hérédité s'exprime par un complexe abordé par Jacob, Monod et Lwoff en 1965 (prix Nobel):
• ADN --> ARN messager --> Protéine (Transcription --> Traduction)

Complexité et diversité d'une cellule

• Les cellules peuvent échanger de l'ADN entre espèces.
• L'infection d'une cellule par un virus de l'ADN insère l'ADN viral dans l'ADN cellulaire.
• Les protéines virales sont traduites, et des particules virales sont synthétisées pour infecter d'autres cellules.
• Les virus ont permis un échange d'ADN entre espèces qui contribue à l'évolution humaine.
• Le génome humain est constitué de 10% de génome viral.
• Des virus modifiés peuvent être utilisés en thérapie génique dans le cadre de maladies génétiques.
• La transfection cellulaire est l'introduction artificielle d'ADN plasmidique bactérien codant pour un gène d'intérêt.
• Naturellement, l'ADN plasmidique contient souvent un gène de résistance aux antibiotiques.
• Les constituants des cellules sont des sucres, des nucléotides, des acides aminés, des lipides, de l'eau et des ions.
• La complexité d'une cellule dépend du nombre de gènes.
• Une bactérie simple a 480 gènes et 600 000 nucléotides.
• Une cellule humaine a entre 20 000 et 30 000 gènes et ≈ 3,2 milliards de nucléotides
• Les trois domaines dans lesquels les cellules sont classées sont les bactéries, les archébactéries et les eucaryotes.
• Il existe toujours des procaryotes unicellulaires.
• Les protistes unicellulaires eucaryotes sont des exemples de levures.
• On considère que la cellule universelle (LUCA) est à l'origine de l'apparition de la première cellule sur terre.

Être vivants / Eléments du vivant

• Un organisme peut s'auto-répliquer = développement autonome.
• Les procaryotes ont de l'information génétique : ADN.
• Les eucaryotes ont de l'information génétique : ADN.
• Certains assemblages de molécules vivantes sont incapables d'auto-reproduction comme
  • Les virus : Information génétique: ADN ou ARN
  • Les prions: Information génétique: 1 seule protéine (A l'origine de la vache folle, A l'origine de la maladie de Creutzfeldt-Jakob découverte chez les aborigènes)

Petit rappels de taille

• La taille des eucaryotes est en moyenne de 10 μm = 10^-5 m.
• La taille des procaryotes est en moyenne de 1 μm = 10^-6 m.
• La taille des virus est en moyenne de 100 nm = 10^-7 m.
• La taille des molécules/prions: 1 nm = 10^-9 m.
• La taille des atomes est en moyenne de 10^-10 m.
• La microscopie optique permet d'observer jusqu'à la bactérie, mais l'observation de virus est impossible.
• La microscopie électronique permet l'observation depuis l'échelle cellulaire jusqu'aux protéines.
• L'approche par rayons X permet la visualisation des structures des éléments, et la détermination de la structure de protéines, voire de structures plus petites jusqu'à l'atome.

Différence entre procaryotes et eucaryotes

• Les procaryotes sont des cellules primitives ressemblant à un gros sac, avec une absence de compartimentation.
• Leur unique chromosome est composé d'ADN circulaire.
• Les eucaryotes sont composés d'une ou plusieurs cellules.
• Le noyau est séparé du reste de la cellule par une enveloppe nucléaire.
  • Il existe un nucléole.
  • Il y a mécanisme d'épissage de l'ARN.
  • Il existe plusieurs chromosomes différents.
  • Des histones sont présents au sein de l'ADN.
• Il existe une présence de cytomembranes: système de membranes internes.
• Il existe une présence d'un cytosquelette.
• La présence de cholestérol est signe d'une cellule animale.

Eucaryotes: Système de membranes internes

• Noyau: renferme l'ADN
• Mitochondries : énergie
• Chloroplastes: photosynthèse, cellule végétale
• Réticulum endoplasmique: synthèse des lipides et de protéines
• Appareil de Golgi: modification des protéines
• Lysosomes: compartiment de dégradation
• Peroxysomes: dégradation d'acides gras et production de chaleur
• Le système de membranes internes a differents rôles et foncions comme :
• L'isolement des différentes fonctions de la cellule (Compartimentalisation structure / fonction) exemple: synthèse protéique et dégradation protéique
• L'augmentation de la surface de membrane : nombreuses enzymes cellulaires ont besoin d'un ancrage sur une membrane
• La création de gradients électrochimiques au sein des membranes : Les mitochondries assurent par ce mécanisme une production d'énergie
• Il y a un besoin de communication entre compartiments par de systèmes de transports complexes entre compartiments cellulaires via l'intervention du cytosquelette.

3,5 milliard d'années d'évolution des génomes

• Les modifications de l'ADN sont accidentelles, apportant de nouvelles propriétés ou non, et sont conservées dans le temps si elles confèrent un avantage.

  • Neutre: sans effet.
  • Effet positif (Gènes sélectionnés et rares)
  • Effet négatif (Gènes non sélectionnés et fréquentes)

• Mutations:

  • Effets variables.Exemple de mutations dans les séquences répétées, des décalages, dans des séquences de régulation.

• Conséquences de l'évolution:

  • Peu d'évolution : Gènes conservés au cours de l'évolution (gènes essentiels) Exemple des gènes des histones quasi identiques entre celui de nos cellules, et celui d'une cellule primitive de levure.
  • Fortes évolutions : Gènes tolérants aux mutations, et gènes tolérants aux mutations. Différence importante entre le gène humain et le gène de la levure.

• Famille de gènes

  • Famille de plusieurs gènes identiques créée à partir d'un gène ancestral.

• Duplication

  • Evolution indépendante de chaque copie de gène.
  • des fonctions similaires.Exemple de la famille de l'actine: actine, Arp2, Arp3...

Histoire des découvertes

• 1600 : Premier microscope optique (observation d'insectes et de tissus)
• Fin du 18ème : Naissance de la biochimie
• 1930 : Premier microscope électronique à transmission.
• 1960-70 : Essor de la biologie moléculaire (compréhension du fonctionnement de la cellule à l'échelles des molécules)

Introduction à la biologie moléculaire

• ADN (Génome = ensemble des gènes / Recherche des mutations par séquençage)
• ARN (Transcriptome = Ensemble des ARNs messagers)
• Protéine (Protéome = ensemble des protéines / Etude du protéome plus difficile)

PCR

• Amplification exponentielle de l'ADN
• PCR permet d'isoler et d'amplifier des petites séquences que l'on a choisies au sein du génome.
• Le principe est de recopier de nombreuses fois la petite séquence d'intérêt pour une étude ultérieure.
• La photocopieuse est une ADN polymérase Taq.
• L'encre est constituée des bases A, T, G, C.

Analyse qualitative de l'ADN : Séquençage de l'ADN

• Le séquençage est effectué après l'amplification d'une séquence d'intérêt par PCR.
• Le principe du séquençage est le marquage de chaque base avec une molécule fluorescente spécifique.
• La fluorescence est lue via un séquenceur (Détermination de la séquence, Analyse bio-informatique).
• L'analyse d'une mutation mise en cause dans le cancer donne des informations sur le pronostic, mais également la résistance à certains traitements.
• Le séquençage d'un proto-oncogène est exemple de l'analyse d'une cellule tumorale.

Le code génétique (analyse qualitative de l'ADN)

• Le sens de lecture du codon est important:
  • 1 codon d'initiation: ATG codant la méthionine
  • 3 codons STOP: TAA, TAGO et TGA

Différents types de mutations (analyse qualitative de l'ADN)

• Mutations Silencieuses (Pas de changement dans la composition des acides aminés)
• Mutations Faux-sens (Remplacement par un mauvais acide aminé = Changement dans la composition de la protéine)
• Mutations Non-sens (Introduction prématurée d'un codon stop, donc Synthèse d'une protéine plus courte)
• Les Mutations Non-sens possèdent des effets toujours délétères.

PCR quantitative

• Quantification de l'ADN présent avant la PCR (par des formules mathématiques)
• A chaque réaction de PCR, on double la quantité d'ADN (2 nombre de cycles de copies)
• Après chaque cycle, un agent fluorescent comme le bromure peut être ajouté.
• Proportionnalité directe entre le nombre de copies de la séquence étudiée et le niveau de fluorescence.

Exemple de Q-PCR

• Nécessité d'une prise de sang mensuelle chez le patient chronique pour le suivi du traitement.
• Pour le Suivi de traitement d'un patient chroniquement infecté avec le virus de l'hépatite B, réalisation d'une Q-PCR sur le génome viral pour la détermination du nombre de particules virales / mL de sang chez le patient en fonction de la quantité d'ADN
• 1 copie = 1 virus infectieux.
• Suivi de la charge virale
• Evaluation de l'efficacité du traitement lors de sa mise en place :
  • Réponse efficace: charge virale quasi-nulle
  • Réponse nulle ou partielle: baisse de la charge virale faible voire nulle (Nécessité d'un changement du traitement)
• Visualisation de l'augmentation de la charge virale lors d'une rechute :
  • Soit le virus a muté et résiste (Nécessité d'un changement du traitement)
  • Soit le patient a arrêté le traitement

Quantification de l'expression des gènes

• L'étude de l'ARN comprend l'analyse de la transcription inverse avec
  • Extraction des ARNs (ARN non purifiable: il est très fragile, PCR impossible sur l'ARN)
  • Utilisation d'une reverse transcriptase afin d'obtenir des ADNc, transcription inverse et les transcriptase inverse que l'on retrouve chez les rétroviru
• RT-PCR quantitative
  • Transcription inverse + PCR = RT-PCR & Transcription inverse + Q-PCR = RT-Q-PCR
  • Mesure le niveau d'expression des gènes (ex: L'étude des ARNs messagers reflète l'activité cellulaire)
• Evaluation de la duplication dans des cellules cancéreuses ou non.
• Analyse du nombre des copie pour un proto-oncogene. Ce qui va affecter le cycle cellulare, la proliferation et le développement tumoral
• Depistage de l'infection au Sars Cov-2:

• • Etude du taux d'ARN viral dans le sang grace à la RT-PCR quantitative, Diagnostic sensible grâce à l'amplification de l'ADNc viral.

Séquençage Haut Débit (NGS)

• Le NGS est un séquenceur, c'est à dire une machine très rapide et efficace.
• Le NGS fonctionne pour l'ADN et l'ARN.
• Il permet en une seule fois de séquencer l'ensemble des gènes d'un organisme (un génome ou un transcriptome).
• On peut faire plusieurs analyses NGS:
  • Séquençage
  • Mutations
  • Altérations génomiques et transcriptomiques
• Pour les études quantitatives, le NGS peut mesurer les Niveaux d'expression d'un panel de gènes (sous-expression ou sur-expression en fonction du type cellulaire)

Les différentes techniques de microscopie

• Microscopie optique:
• Au 17ème siècle: Premières observations par Hooke, reproduction d'une puce, puis descriptions spermatozoïdes
• Théorie cellulaire de Schleiden et Schwann en 1839: Tous les êtres vivants sont constitués de cellules
• Nature ondulatoire de la lumière Le longueur d'onde est exprimé en nm et permet de voir différentes couleurs: Ultraviolet < 400 nm Visible <400 < 760 nm Infrarouge <760 nm
• Dans la théorie: Le génération de diffraction lorsque la lumière rencontre un obstacle: Entrain l'apparition de tâches de diff,Définit une limite de résolution ou pouvoir séparateur (distance minimale par laquelle on distingue 2 points distant, 0,2 mm), permet la détection des bactérie
• La microscopie est importante avec une obtention d'images en couleurs, une préparation plus simple et plus rapide, pouvoir de penetration superieur on peut observer directement des cellules vivantes en déplacement grâce à la vidéomicroscopie.
• Pour l'histologie:
  • On peut observer l'organisation des cellules et différents types cellulaires (biopsie à l'aide d'un microtome afin d'obtenir la composition et la coloration des cellules) les cellules sont spécifiques aux structures à l'aide de colorants spécifiques
• En microscopie, observation direct des cellules, des phases contrastés, observations des cellules, des marqueurs lumineux et cellulaires.
• Immunomarquage: Liaison d'une multitude d'anticorps secondaire est spécifique au domaine de l'anticorps primaire (couplés à un marqueur observable au microscope) qui permet d'amplifier la reconnaissance et la concentration de marqueurs cellulaires qui permet d'entrer les anticorps dans les cellules.
• Dans une cellule on voit des enzymes, des structures en or.
• Une molécule "marqueur" fluorescent excitée.
• On peut marquer L’ADN, et les protéines membranaires pour voir les composants de la membrane les uns par apport aux autres, mais Les 2 protéines ont 2 localisations bien distinctes: absence d'interaction.
• Combinaison de co-marquage en immunofluorescence avec la réalisation de tranches optiques.
• Utilisation de lasers et de lentilles très performants.
• Réalisation d'image dans toute l'épaisseur de la cellule.
• Empilement d'images qui sont ensuite associée en 3 dimensions.

Microscopie electronique

• Une source de de faisceaux d'électrons incidents
• Vidéos, images superbes, on peut regarder des observations cellulaires mais c'est un processus complexe et difficile car c'est en vide, et les images sont monochromes.

Microscopie éléctronique/transmission

• Enregistrement des électrons sont enregistrés, sont utilisées des coupes ultrafines pour permettre l'enregistrement et avec des métaux lourd pour aider la lecture.