Introducción y Historia de la Biotecnología

Introducción a la Biotecnología

• La biotecnología es una disciplina que utiliza organismos vivos o partes de ellos.
• Se usa para desarrollar, modificar productos o crear organismos con nuevas características.
• La biotecnología es el uso de sistemas biológicos y sus partes para producir bienes y servicios.
• La producción de pan, cerveza y yogur son ejemplos de biotecnología tradicional.

Historia de la Biotecnología Moderna

• En 1953, Watson y Clark visualizaron la doble hélice del ADN.
• En 1970, se sintetizó un gen completo in vitro y se descubrieron la endonucleasa y la transcriptasa inversa.
• El gen sintetizado en 1970 medía 77 nucleótidos y tardó 5 años en obtenerse.
• En 1972, se obtuvieron las primeras moléculas de ADN recombinante.
• Se descubrió que el ADN chimpancé-humano es 99% similar.
• En 1973, se comenzaron a utilizar vectores plasmídicos para la donación de genes.
• En 1975, el Dr. Southern desarrolló el "Southern Blot", una técnica donde dos fragmentos de ADN complementarios se pegan y brillan.
• En 1977, se desarrollaron métodos de secuenciación rápida de ADN, asignando un color a cada base en un cromatograma.
• En 1979, se logró la síntesis de insulina recombinante cuyo investigador original ganó el Premio Nobel, pero no patentó su descubrimiento.
• En 1982, la insulina humana se produjo comercialmente en E. coli, antes se usaba páncreas de cerdo.
• En 1983, se desarrolló la PCR.
• En 1987, la inserción de un gen funcional curó la enfermedad por mutación "Shiverer" en embriones de ratones.
• La mutación era letal, pero al añadir el gen modificado, se evitó la mutación letal.
• En 1994, se aprobó el primer transgénico “Flavr Savr” para conservar la textura fresca del tomate en supermercados.
• En 1994, se desarrollaron anticuerpos monoclonales humanos en ratones.
• En 1995, se secuenció el genoma completo de Haemophilus influenzae, con 1,740 genes y 1 millón de pares de bases.
• En 1997, se clonó la oveja Dolly.
• En 2003, se completó el Proyecto Genoma Humano.
• En 2006, se desarrollaron células madre pluripotentes.
• En 2010, se desarrolló la primera célula sintética.
• En 2012, se desarrolló CRISPR-Cast9.
• En 2015, se aprobó la primera terapia génica en EUA.
• En 2017, se aprobó el primer tratamiento CAR-T, modificando células cancerígenas en cultivo y devolviéndolas al paciente.
• En 2018, nacieron los primeros bebés editados genéticamente.
• En 2020, se aprobaron las vacunas de ARNm contra el COVID-19.
• En 2022, se realizó la primera edición genética exitosa en embriones humanos con CRISPR.
• En 2023, el Dr. Floyd Romesberg utilizó bases nucleotídicas sintéticas, ampliando la biotecnología en el desarrollo.

Futuro y Presente de la Biotecnología

• CRISPR-CAS9 se utiliza para edición genética precisa, tratando enfermedades genéticas y mejorando cultivos.
• Se están desarrollando vacunas de ácidos nucleicos.
• Se están investigando biomateriales.
• Se está aplicando la agricultura de precisión.
• En el futuro se espera medicina personalizada, biología sintética, alimento de laboratorio y terapia génica.

Biología Molecular e Ingeniería Genética

• En 1973, Stanley Cohen y Herbert Boyer desarrollaron la metodología para transferir genes de un organismo a otro.
• La ingeniería genética proporciona la capacidad para desarrollar cepas superproductoras.

Plásmidos

• Los plásmidos son moléculas circulares de ADN bicatenario autoreplicativas en bacterias.
• Actúan como entidad extracromosomal independiente.
• Los vectores de expresión son relevantes por su capacidad de transportar genes de interés.
• Los sistemas de expresión pueden ser virus, fragmentos de ADN lineal o plásmidos.
• Todos los plásmidos pueden ser vectores, pero no todos los vectores son plásmidos.

Partes de un Plásmido

• Los componentes esenciales de un plásmido son: gen de interés, sitio de multiclonación, promotor, origen de replicación y gen de resistencia.
• El sitio de multiclonación o polylinker es una región con múltiples sitios de reconocimiento para enzimas de restricción (endonucleasas) que permiten insertar fragmentos de ADN.
• Las endonucleasas son enzimas que cortan el ADN en sitios específicos dentro de la cadena.

Clonación Molecular

• El método de ensamblaje de Gibson para la clonación molecular usa producto de PCR de ADN de doble hebra lineal.
• La novedad es hacer PCR al inserto y al vector.
• El marcador de selección (AmpR) o resistencia permite la identificación positiva y selección de clonas recombinantes.
• El origen de replicación u Ori es la región codificante para el inicio de la síntesis de ADN.
• Los elementos para la expresión son promotores y el sitio de unión al ribosoma (RBS).
• El plásmido debe tener un Ori para permitir la copia dentro de la bacteria.
• El plásmido debe tener marcadores de selección (AmpR) para que solo crezcan bacterias con el plásmido.
• El plásmido debe tener un MCS para cortar, abrir e insertar el gen de la proteína fluorescente usando endonucleasas.
• El plásmido debe tener un promotor que activa la expresión del gen y regula cuándo y cuánto se expresa un gen.

Tipos de Vectores

• Los vectores son moléculas de ADN diseñadas para transportar y transferir genes de interés a una célula.
• Algunos tipos de vectores son los plasmídicos y bacteriófagos

Bacteriófagos

• Los bacteriófagos son altamente específicos, infectan específicamente a las bacterias y son herramientas en biología molecular como vectores de clonación.
• Tienen ciclos líticos y lisogénicos.
• El ciclo lítico se replican dentro y causan destrucción
• En el ciclo lisogénico el ADN del fago se integra en el genoma bacteriano y se replica
• El despliegue en fagos es crucial en la ingeniería de anticuerpos y en el descubrimiento de fármacos.
• En el bacteriófago M13 (filamentoso), del griego fago = comer, la cápside es larga y delgada.
• Contiene un genoma de ADN de cadena sencilla (ssDNA) dentro de la cápside proteínica.
• No es lítico ni lisogénico, sigue un ciclo de infección crónica.

Cósmidos

• Los cósmidos consisten en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacteriófago (fago lambda).
• Contienen: el Ori y el gen de resistencia (antibiótico) del plásmido, dependiendo del tipo de plásmido del cual derive.
• También puede contener más segmentos, por ejemplo, el gen LacZ, que permite la selección de colonias (blanco/azul).
• Tienen los extremos COS (200 pb aprox) del fago, esenciales para el empaquetamiento.

Cromosomas Artificiales

• Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) son vectores para clonar grandes fragmentos de ADN, típicamente de 100 kb hasta 1 megabase.
• Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son vectores para clonar fragmentos de ADN de tamaño intermedio, típicamente de 100 a 300 kilobases.

Enzimas de Restricción (Endonucleasas)

• Las enzimas cortan el ADN en secuencias específicas (sitios de restricción).
• Las endonucleasas cortan dentro del ADN y las exonucleasas cortan por fuera.
• La universalidad del código genético permite el desarrollo de tecnologías para la producción de proteínas “extrañas” en sistemas de expresión.
• El código genético es un sistema de “lectura” que cualquier célula puede leer.

Sistemas de Expresión

• Los sistemas de expresión y métodos de purificación son un conjunto de herramientas y procedimientos diseñados para producir proteínas recombinantes a partir de genes clonados de un organismo huésped.
• Hay sistemas de expresión en bacterias, levaduras, células vegetales, insectos y mamíferos.
• Las bacterias actúan como sistemas rápidos y simples para expresar proteínas recombinantes debido a su corto tiempo de duplicación.
• Las bacterias son accesibles, de fácil escalamiento (biorreactores) y bien conocidas genéticamente.
• Las proteínas expresadas en bacterias pueden requerir amplias pruebas antes de su uso clínico

Células de Mamífero

• Son ideales para proteínas que requieren modificaciones post-traduccionales complejas y funcionales, como tener azúcares en las proteínas (glucoproteínas), la glucosificación es muy importante.
• La expresión transitoria es “fácil”, pero el escalamiento es técnicamente difícil por los puentes disulfuro.
• El proceso de selección y expansión toma 2-3 meses.
• Son altamente usadas para la producción de proteínas complejas que requieren modificaciones post-traduccionales específicas y un plegamiento adecuado, similar al encontrado en los humanos

Sistemas de Expresión en Mamíferos

• El sistema transitorio no se integra al genoma, es de uso temporal en la célula y se produce rápido.
• El sistema estable permanece activo de manera permanente pero es más lento y puede tener una integración errónea del ADN.
• Las células HEK293 (células embrionarias de riñón humano) se transfieren transitoriamente usando liposomas, fosfato de calcio o PEG como reactivos de transfección.
• Las células CHO (células de ovario de hámster chino) se usan comúnmente para expresar de forma estable grandes cantidades de proteína recombinantes.
• Las células de insecto son costosas.
• Producen proteínas recombinantes y modificaciones postraduccionales más complejas

Otros Tipos Celulares

• Las células de insectos son versátiles, glicosilan y permiten un plegamiento adecuado.
• Realizan modificaciones más similares a las de células de mamíferos.
• Pueden ser cultivadas en suspensión y biorreactores.
• Para la traducción de proteínas se ocupan ARNm, ARNt y ribosomas.
• El ribosoma lee varias bases nitrogenadas hasta encontrar el codón AUG (metionina) y de ahí empieza a traducir los codones.
• La disociación de ribosoma es cuando el ribosoma se separa por no tener el ARNt y ahí frena la proteína, incompleta.
• UAA, UGA y UAG son codones de terminación.

Expresión Libre de Proteínas (Cellfree)

• Es la producción de proteínas recombinantes en solución utilizando maquinaria de traducción biomolecular extraída de células.
• Se puede hacer siempre y cuando se tenga energía, aminoácidos, ribosomas y sea costeable y escalable.

Purificación

• Es un proceso destinado para aislar una o unas pocas proteínas de una mezcla compleja (células, tejidos, organismos).
• Los métodos de purificación incluyen: cromatografía de exclusión de tamaño

Cromatografía

• En la cromatografía de exclusión de tamaño, las proteínas grandes se desplazan y salen primero, las chicas entran a esferas de sefarosa por porosidad.
• La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es una técnica de química analítica que separa compuestos en una mezcla de sustancias químicas.
• La separación a base de carga funciona con perlas de polímero con grupos funcionales cargados negativamente.
• La mezcla de las proteínas se añade a la columna que contiene intercambiadores de cationes.
• Las proteínas se desplazan por la columna a velocidades determinadas por su carga en el pH utilizado.
• Las proteínas con una carga neta más negativa se mueven más rápidamente y eluyen antes
• En la separación por hidrofobicidad (HIC), se usa una resina con grupos hidrofóbicos.
• En altas concentraciones de sal, las proteínas se unen a la resina (se expone la parte hidrofóbica).
• Al reducir la concentración de sal, las proteínas se eluyen en orden de hidrofobicidad.
• Las cromatografías de inmunoafinidad se especializan en antígeno-anticuerpo.
• Se inmoviliza un anticuerpo específico en una resina.
• La proteína de interés se une al anticuerpo y las impurezas se lavan.

Métodos para Manipular Organismos

• La transformación, descubierta por Frederik Griffith en 1928, es el principio de transformación con pneumococcus.
• El factor de transformación, descubierto por Avery et al. en 1944, es el ADN.
• El experimento de Hershey & Chase en 1953 descubrió que el factor de herencia era el ADN.

Transformación Química

• Las membranas y el ADN tienen carga negativa.
• En el mecanismo de choque térmico, se añade cloruro de calcio o magnesio a E. coli.
• Se induce calor para crear choques térmicos, neutralizando la carga negativa del ADN y se abren los poros de membrana para meter el ADN.
• Se enfría en 4°C para cerrar el poro.
• En el mecanismo de microinyección se usa una micropipeta de vidrio para inyectar el ADN a nivel microscópico.
• El gen gun (biobalística) se usa para la transformación de plantas.
• Un dispositivo balacea ADN a las células usando nanopartículas de oro envueltas de plásmido.
• Desventaja: Integración aleatoria a los organelos, daño a la célula, no todas las partículas entran, no aplica en bacterias
• Ventaja: Integración aleatoria a los organelos
• La electroporación es más eficiente que el choque térmico.
• Se aplica un choque eléctrico a las células para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares, permitiendo que el ADN entre.
• Se aplica en bacterias y eucariotas, utilizando un electroporador como equipo ($$$).
• En el mecanismo con bacteria Agrobacterium, Agrobacterium tumefaciens se usa para transformar células vegetales.
• Se aisló de pequeños tumores de raíces de plantas.
• En biotecnología aprovechan el funcionamiento de desarrollar un tumor, para meter el ADN de interés.
• Todos estos deben de tener un medio selectivo

Importancia de la Biotecnología en la Producción

• La microbiología industrial se enfoca en producir productos de valor económicos relativamente bajos (enzimas, antibióticos, etc).
• La biotecnología se enfoca en producir productos de valor de alto valor económico, modificándolos genéticamente.
• Los microorganismos son importantes en la industria alimentaria.
• Pasteur inició estudios sobre el mecanismo de la fermentación alcohólica de las bebidas alcohólicas.
• Una desventaja es el rechazo social por ser OMG, el sabor podría cambiar.
• Las ventajas son el menor costo de recursos utilizados y menor tiempo de fabricación.
• En la industria de la belleza, los efectos del botulismo se describen desde 1820 y se usan en tratamientos de belleza facial.
• Las proteínas heterólogas son aquellas que provienen de un organismo y se expresa en otro organismo (célula de humano a bacteria ejemplo).
• Usan promotores de naturaleza externa (como por ejemplo los virus obligando a que se exprese un inserto) para la sobrexpresión de proteínas.
• rBST (somatotropina de bovino recombinante) es una proteína que indica que siga produciendo más leche al ser inyectada en el ADN del ganado, ya no se practica.
• La proteína tiene 2 sitios activos para estimular más la lactancia.
• En el pasado, las enzimas microbianas eran tratadas en radiación o mutagénicos para alterar su ADN de una manera aleatoria para aislar a los sobrevivientes con una versión mejorada.
• La producción de aminoácidos alpha comenzó como el aislamiento.
• Hay bacterias genéticamente modificadas que convierten la naftalina a índigo para teñir ropa color blue jeans para reemplazar el cianuro
• También la biotecnología sirve para crear biocombustibles y piel sintética.

Sesiones de Laboratorio

• Los primers son una corta secuencia de nucleótidos (ADN) que se utiliza para iniciar la síntesis de una nueva cadena de ADN.
• El primer es complementario a la secuencia de ADN de la cadena molde y se une a ella, sirviendo como punto de inicio para la polimerización.

Resumen del ciclo (en PCR)

1. Desnaturalización (separación de las hebras de ADN).
2. Anexado del primer (hibridación de los primers con las cadenas molde).
3. Polimerización (síntesis de la nueva cadena de ADN).
4. Repetición de estos pasos para amplificar la secuencia de interés.

• En el anexado, los primers se pegan de 3' a 5'.
• En la polimerización se polimerizan de 5' a 3'.
• Se recomienda un máximo 5°C de diferencia entre las temperaturas de los primers.

PCR: Reacción en Cadena de Polimerasa

• Es una técnica de biología molecular utilizada para amplificar fragmentos específicos de ADN.
• Para protocolos estandar se ocupa buffer (10x), MgCl2 (en mM), dNTPs (en mM), primers (Cebadores en mM), Taq. Polimerasa (en U/microlitro), ADN molde (microlitro) y H2O (agua ultrapura).
• Preparación de mezcla de PCR (en bitácora)
• La fase Taq. Polimerasa se pone al final, esta se expulsa en la micropipeta al segundo tope, ya que contiene glicerol y es más viscoso y se hace la programación del Termociclador
• En las fases de PCR la temperatura de alineamiento (annealing) depende de los primers.
• En la desnaturalización térmica del ADN hay 3 puentes de hidrógeno entre C y G lo que hace que cueste más romperlos
• Entre A y T hay solo 2 puentes de hidrógeno
• Las aplicaciones son diagnostico molecular (COVID-19, VIH, cáncer), identificación de especies (Barcoding genético), Estudios de expresión génica (RT-PCR) e Ingeniería genética y clonación
• Los resultados se obtienen por medio de un análisis por electroforesis en Gel de agarosa.
• Electroforesis de poliacredamida se usa cuando es para proteínas
• Electroforesis de agarosa se usa cuando es para ADN.