T12 Introducción al Microscopio

Introducción al Microscopio y Objetivos

• El microscopio es crucial en medicina y biología para entender la morfología y función de células y tejidos, permitiendo entender la diferenciación celular, enfermedades y tratamientos.
• Los avances tecnológicos han impulsado la evolución del microscopio, adaptándolo a diversas funciones y estudios de laboratorio.

Historia e Importancia del Microscopio

• La palabra "microscopio" viene del griego "micros" (pequeño) y "skopein" (examinar), definido por la RAE como un "instrumento óptico para observar objetos pequeños no visibles a simple vista".
• La óptica permite conocer la formación de imágenes de muestras a través de la microscopía.
• Hans Janssen e hijo fabricaron anteojos que fueron los inicios del microscopio.
• Galileo Galilei es importante para la microscopía.
• Robert Hooke observó la estructura interna del corcho en 1665 y nombró "célula" a las celdas observadas.
• Antoine Van Leeuwenhoek fabricó el microscopio simple y observó protozoos, bacterias, glóbulos rojos y espermatozoides.

Tipos de Microscopios

• Los microscopios se dividen en ópticos y no ópticos.
• Los microscopios ópticos usan lentes para observar muestras mediante la refracción de la luz.
• Los microscopios ópticos simples tienen una sola lente.
• Los microscopios ópticos compuestos tienen un sistema de lentes (objetivo y ocular) y pueden aumentar las imágenes hasta 1000 veces.
• Microscopios no ópticos incluyen los electrónicos, protónicos, de excitación (electrones o fotones) e Iónicos.

El Microscopio Óptico

• El microscopio óptico, también conocido como microscopio de luz o de campo claro, se compone de un sistema mecánico, óptico y de iluminación, además de accesorios.

Sistema Mecánico del Microscopio

• La estructura del microscopio depende de sus dimensiones, forma, fabricante y coste.
• Esta estructura incluye la base, columna, sistema de enfoque, platina, revólver y tubo.

Sistema Óptico del Microscopio

• El sistema óptico está formado por los objetivos (insertados en el revólver) y el ocular.

Sistema de Iluminación del Microscopio

• El sistema de iluminación está compuesto por la fuente de luz, el condensador y el diafragma.

Accesorios Adicionales

• Los accesorios incluyen cámaras fotográficas, de vídeo y ordenadores.
• Estos accesorios facilitan la medición, cuantificación, fotografía de imágenes en movimiento, procesamiento de vídeos y dibujo de muestras.

Parte Óptica en Detalle

• La parte óptica del microscopio incluye objetivos y oculares y el sistema de iluminación (condensador, diafragma y fuente de luz).

Objetivos

• Los objetivos recogen la luz de la muestra para proyectar su imagen, insertados en el revólver para cambiar entre aumentos (4x, 10x, 40x, 100x).
• Objetivos de inmersión necesitan aceite para mayor resolución.
• Existen objetivos según las correcciones o problemas en la observación.

Oculares

• Los oculares (monoculares o binoculares) permiten observar las muestras, actuando como lupa adicional a los objetivos.
• El aumento total se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular.
• Lentes oculares aumentan la imagen real del objetivo.
• Lentes colectoras aplanan y aclaran el campo óptico.

Parte Mecánica en Detalle

• La parte mecánica incluye la base, columna, platina, sistema de enfoque, pinzas, tubo o cabezal y revólver.

Componentes Mecánicos del Microscopio

• Soporte o base: estabiliza el instrumento y soporta la columna, alojando el sistema de iluminación.
• Columna o brazo: sujeta el tubo del microscopio.
• Platina: soporta las muestras, con una apertura para el haz de luz del condensador.
• Sistema de enfoque: incluye tornillos macrométricos y micrométricos para el desplazamiento de la platina y el ajuste de la muestra.
• Tornillo macrométrico: ajusta verticalmente la platina para un primer enfoque.
• Tornillo micrométrico: permite un enfoque fino, usado en objetivos de mayor aumento (40x y 100x).
• Pinzas: sujetan la muestra en la platina (portaobjetos y cubreobjetos).
• Revólver: contiene los diferentes objetivos.

Técnicas Microscópicas: Campo Claro

• El microscopio utilizado para el campo claro es el más simple y permite que la luz atraviese y refleje la luz en las muestras sin alterarlas
• Muestras teñidas (azul de metileno, permetrina o pigmentos naturales).
• Se usa en cortes finos histológicos de tejidos animales y vegetales, hematología (muestras sanguíneas), orina y heces (parásitos), líquidos biológicos (líquido cefalorraquídeo, pleural, articular, endocérvix).
• No se puede usar en muestras sin tinción (observación dificultosa) ni para componentes subcelulares.
• El aumento máximo suele ser menor.

Resolución en Microscopía

• La resolución es la capacidad del microscopio de mantener aislados dos puntos próximos entre sí.
• El límite de resolución o poder de resolución está influenciado por la longitud de onda (A) y la apertura numérica (AN).
• El aceite de inmersión (en objetivos de 100 aumentos) aumenta el índice de refracción del medio, mejorando la resolución.

Campo Oscuro

• La técnica de campo oscuro es útil para estudiar células vivas o muestras sin teñir, mejorando la resolución.
• Se usa para observar muestras biológicas transparentes sin pigmentación (microorganismos acuáticos, cultivos celulares, células móviles, procesos mitóticos, diferenciación celular).
• Utiliza iluminación Rheinberg (filtros de colores para la muestra y el fondo oscuro) para destacar las estructuras.

Contraste de Fases

• El microscopio de contraste de fases permite estudiar muestras transparentes aumentando el contraste entre zonas claras y oscuras.
• Inventado por Frits Zernike, quien ganó el Premio Nobel de Física en 1953.
• Proyecta un haz de luz más estrecho reduciendo la intensidad y produciendo el cambio de fase.
• Se necesita cambiar el condensador y objetivos especializados (filtro en anillo y placa de fases).
• Sirve para observar células y tejidos vivos, procesos celulares, parásitos, y el efecto de medicamentos en las células.
• Además, es empleado en estudios de minerales y materiales industriales.

Microscopía de Fluorescencia

• Permite observar muestras muy pequeñas gracias a la luz que emiten.
• La fluorescencia es la capacidad que tiene algunos elementos químicos de emitir luz visible, es decir, de captar luz de una longitud de onda para proyectar una luz de mayor longitud a la captada.
• Los fluoróforos (fluorocromos) tienen un espectro de absorción y emisión específico.
• Los más utilizados rodamina (luz roja), GFP (luz verde) y DAPI (luz azul).
• Necesita una fuente de luz intensa (longitud de onda corta), filtros que inhiban longitudes no deseadas y objetivos con gran apertura numérica.
• Usada en biología y medicina para marcar moléculas en células y tejidos y en estudios inmunológicos.

Contraste de Polarización y Contraste Interferencia Nomarski

• El microscopio de luz polarizada, o contraste de polarización, es útil para estudiar muestras birrefringentes (que desdoblan el rayo de luz).
• Compuesto por dos filtros polarizados (uno entre el condensador y la muestra, otro entre la muestra y el ocular).
• Se usa para estudiar sustancias cristalinas como el citoesqueleto o fibras de colágeno.
• La microscopía de contraste interferencial de Nomarski (DIC) se usa en fertilización in-vitro, células vivas y muestras que no admiten contraste de fases.
• Formada por dos rayos de luz polarizada (uno proyecta luz sobre la muestra, otro lateralmente).

Microscopía Confocal

• En 1995, Marvin Minsky inventó el microscopio confocal para estudiar neuronas.
• Similar al microscopio de fluorescencia, permite obtener imágenes tridimensionales de células y tejidos (muestras fluorescentes mediante cortes finos, entre 0,5 y 1,5 μm).
• Requiere un sistema de luz (rayos láser multifrecuencia) y un filtro de interferencia.
• El láser se proyecta sobre la muestra (marcada con fluoróforos).
• El microscopio mide la fluorescencia emitida tras el barrido del láser.
• Las imágenes 2D se convierten en 3D con programas informáticos.
• Utilizado en biología celular y biomedicina para estudiar procesos celulares, como reacciones de oxidación, fagocitosis, estudios de ADN y ARN, comunicaciones intercelulares.

Caso Práctico 1: Problemas en la Observación Microscópica

• Los problemas pueden ser imágenes no nítidas o el desplazamiento de la muestra.
• Las aberraciones (errores) pueden causar imágenes borrosas, dispersas, falta de resolución o exceso de iluminación.
• Es crucial saber manejar el microscopio, conocer sus componentes y funciones, y realizar un mantenimiento adecuado.
• Oscuridad en la periferia: mala unión objetivos (revisar objetivos).
• Imagen borrosa y dispersa: mal uso del aceite o burbujas, muestra mal preparada (usar aceite solo 100X, limpiar porta/cubreobjetos, colocar en platina).
• Suciedad en campo de visión: condensador bajo, diafragma cerrado, lente sucia (ajustar altura condensador/diafragma, limpiar lente).
• Brillos/iluminación inadecuada: objetivo/sistema no centrado, condensador sucio (centrar objetivo/sistema, limpiar lente condensador).

Caso Práctico 2: Micromediciones

• El ocular tiene lentes que amplifican la imagen proyectada por los objetivos, obteniendo un aumento total multiplicando el aumento del objetivo y ocular.
• Si el ocular es 10x y el objetivo es 40x, el aumento total es 400x.
• Algunos oculares tienen un micrómetro para medir.
• Para calibrar a 400x (ocular 10x y objetivo 40x), se alinea la retícula objetiva y ocular.
• Para calcular el valor real de la longitud de cada subdivisión del retículo ocular (VRsub): VRsub (mm/subdivision) = Lp (mm) / #d0 (subdivisión).

Aplicaciones de la Microscopía Óptica

• Se utiliza en biología y medicina.
• Los microscopios de contraste de fases y de contraste de polarización se utilizan en mineralogía e industria.

Tipos de Microscopios y aplicaciones:

• Campo claro: Visualización de tejidos y células teñidos.
• Campo oscuro: Estudio de elementos microbiológicos transparentes sin necesidad de fijación y tinción de la muestra.
• Contraste de fases: Similar al anterior, principalmente se utiliza para estudiar células vivas.
• Fluorescencia: Marcaje de elementos concretos, especialmente útil en estudios genéticos.
• Contraste Interferencial de Nomarski: Muy utilizado para la selección de gametos en técnicas de reproducción asistida.
• Confocal: Reconstrucción y visualización tridimensional de muestras.

Otros Tipos de Microscopios:

• Microscopio estereoscópico: binocular que emite tres dimensiones (3D) utilizado en microdisecciones.
• Microscopio quirúrgico: para microcirugía con iluminación y aumento.
• Microscopio invertido: para cultivos celulares y reproducción asistida (fertilización in-vitro).
• Microscopio de barrido de sondas: para muestras biológicas, moléculas y átomos (microscopio de fuerza atómica) o estudios topográficos (microscopio de barrido térmico).

Resumen

• El microscopio es un instrumento óptico para observar objetos pequeños, revelando la composición de la materia viva.
• Hay microscopios ópticos simples (lupa) y compuestos (campo claro, campo oscuro, etc.).
• El sistema óptico está constituido de un sistema mecánico, óptico y de iluminación, la platina, sistema de enfoque (tornillo macrométrico y tornillo micrométrico), pinzas y revólver.

Conceptos importantes:

• Luz: radiación electromagnética (fotones y ondas).
• Visión: ojos (fotorreceptores) reciben luz que entra por la pupila al cristalino (imagen invertida).
• Lentes permiten enfocar las imágenes.

El microscopio es esencial en medicina y biología para comprender la morfología y función celular. Los avances tecnológicos han impulsado la evolución del microscopio, adaptándolo a diversas funciones en estudios de laboratorio e investigación.