Introdução à Genómica

Introdução à Genómica

• Genoma: Patrimônio genético de um sistema biológico.
• DNA genómico: Todo o DNA na célula (em eucariontes, inclui DNA nuclear, mitocondrial, cloroplastidial e plasmídeo).
• Genómica: Abordagem que determina a sequência nucleotídica de todo o genoma.

Sequenciação

• Surge com a técnica de Sanger, permitindo a determinação da sequência nucleotídica no DNA.
• O desenvolvimento tecnológico permitiu o aumento gradual do poder de sequenciação (de bases para megabases, gigabases), sequenciando genomas cada vez maiores.
• Diferentes métodos de sequenciação foram desenvolvidos com base em protocolos próprios para extração, purificação e fracionamento de DNA.
• A necessidade do uso de ferramentas bioinformáticas surgiu para consolidar a informação genômica.
  • Protocolos públicos dividiam e clonavam segmentos do cromossomo, distribuindo os fragmentos para grupos de pesquisa e sequenciando-os individualmente para, posteriormente, reuní-los através de assembly.
  • Protocolos privados extraíam, fragmentavam e sequenciavam todos os fragmentos, baseando-se em recursos de bioinformática para assembly.

Tecnologia de Sequenciação de Sanger

• Baseia-se na terminação prematura da replicação do DNA usando dideoxinucleotídeos (ddNTPs), que substituem o grupo 3'OH da pentose por um átomo de hidrogênio (H), impedindo ligações fosfodiéster subsequentes.
• Moléculas são incorporadas em tubos separados para determinar as sequências.
• Os fragmentos são separados por eletroforese em gel, revelando a sequência.
• Metodologia moderna usa ddNTPs fluorescentes para a detecção automática e o processamento automatizado. Isto minimiza problemas com radiação.

Sequenciação de Nova Geração (NGS) / Alto Débito (HTS)

• Permite sequenciar uma grande quantidade de amostras simultaneamente, reduzindo custos e tempo para sequenciar genomas inteiros.
• Divide os fragmentos de DNA em pequenos pedaços e os sequencia em paralelo para reduzir o tempo.
• É um passo mais eficiente que a sequenciação de Sanger com muitas sequências paralelas.

NGS: Pirosequenciamento (Roche 454)

• Fragmentação do DNA com enzimas de restrição.
• Ligação de adaptadores às extremidades dos fragmentos.
• Ligação dos fragmentos a esferas de resina.
• Filtragem das esferas não ligadas.
• Adição de reagentes e ciclos de adição de nucleotídeos.
• Medição de luz emitida durante a incorporação de cada nucleotídeo.
• Identificação do nucleótido através da medição de luz.

NGS: Sequenciamento por Síntese (Illumina) / Bridge-PCR

• Fragmentação e preparação/condicionamento de DNA.
• Ligação de adaptadores aos fragmentos.
• Aplicação dos fragmentos em uma placa (flowcell).
• PCR em cada fragmento (amostra amplificada para maior concentração).
• Incorporação sequencial de nucleotídeos.
• Medição da luz emitida com diferentes cores para cada nucleotídeo.
• Utilização de sensores para identificar a ordem de incorporação dos nucleotídeos.

NGS: Sequenciamento em Tempo Real de Moléculas Únicas (PacBio)

• Fragmentação, reparação das extremidades e adição de adaptadores ao DNA.
• Poços reacionais contêm DNA polimerases.
• Incorporação sequencial de nucleotídeos.
• Medição da luz emitida para identificar os nucleotídeos.
• Detecta incorporações de nucleótidos diretamente, em tempo real e simultaneamente em cada molécula em vários poços.

Sequenciamento Nanopore

• Utilizando proteínas transmembranares em membranas artificiais eletro-resistentes (nanopores).
• Fluxo de elétrons é perturbado pela passagem de moléculas de ácidos nucleicos.
• O fluxo muda dependendo do nucleotídeo, permitindo sua identificação.
• Pode sequenciar longos fragmentos de DNA.

Montagem de genomas

• Assembly: Processo de reconstrução de sequências de DNA a partir de fragmentos sequenciados, alinhando regiões sobrepostas para criar contigs (sequências maiores) e, posteriormente, scaffolds (sequências completas de cromossomos).
• É crucial a utilização de softwares bioinformáticos para este processo.
• Existem duas abordagens principais para o assembly: De Novo e Referência
• De novo: não utiliza um genoma conhecido.
• Referência: utiliza um genoma conhecido como referência para agrupar e identificar informações.
• Problemas comuns: Falta de cobertura, Erros de sequenciação e Repetições no genoma.

Explore os conceitos fundamentais da genómica, incluindo a definição de genoma e as técnicas de sequenciação como a de Sanger. Aprenda sobre os avanços na tecnologia de sequenciação e o papel vital das ferramentas bioinformáticas na análise de dados genômicos. Este quiz é ideal para quem deseja aprofundar-se no estudo do DNA e suas aplicações.