HPLC Setup en Mobiele Fase

HPLC en Buffers: HPLC Setup

• HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) is een scheidingstechniek.
• De docent van deze les is MSc. Piet van der Steeg.

HPLC Hardware Setup

• Essentiële componenten van een HPLC-systeem:
  • Mobiele fase + solvent toevoersysteem
  • (Auto-)sampler / sample introductie
  • Kolom / Stationaire fase
  • Detector(en)
  • Chromatografie Data Systeem voor controle en dataverwerking

Mobiele Fase in RP-HPLC

• Meestal worden twee polaire vloeistoffen gemengd voor de mobiele fase in RP-HPLC.
• Eén vloeistof is watergebaseerd en vaak gebufferd, terwijl de andere een organisch oplosmiddel is, zoals methanol of acetonitril.
• De samenstelling kan worden aangepast om het scheidingsproces te optimaliseren.
• Een normale flow rate is 1mL/min; een te hoge flow rate reduceert de resolutie en retentie.
• De exacte samenstelling hangt af van de kenmerken van de stationaire fase en de te scheiden moleculen.
• Het creëren van een vloeistof gradient is essentieel voor het scheiden van complexe matrices.
• Bij een constante samenstelling van de mobiele fase is er sprake van een isocratische modus.

Sample Introductie

• Samples worden in de HPLC geïnjecteerd via een injectiepoort, die bestaat uit een injectieklep en een sample loop.
• De sample wordt opgelost in de mobiele fase en via een injectienaald in de sample loop gebracht.
• Rotatie van de klep sluit de klep en opent de loop, waardoor de sample in de stroom van de mobiele fase komt.
• Loop volumes variëren van 10 μl tot meer dan 500 μl.
• Moderne HPLC-systemen maken gebruik van geautomatiseerde sample injectie.

Kolommen in HPLC

• De vaste drager zijn meestal silica deeltjes van 3, 5 of 10 µm.
• Silica deeltjes zijn sferisch, poreus en uniform van diameter.
• Gebonden fasen zijn stevig gekoppelde functionele groepen aan de vaste drager, die zeer stabiel en reproduceerbaar zijn.
• Een guard kolom beschermt de analytische kolom.
• De kolom is een roestvrijstalen buis, afgesloten met fittingen en stalen of titanium fritten om het verpakkingsmateriaal vast te houden.
• Analytische kolommen hebben diameters van 1-10 mm en lengtes van 25 - 250 mm. De kolom flow rate is 60 µL – 5.0 mL/min.

Stationaire Fase in RP-HPLC

• De componenten van een sample migreren volgens de niet-covalente interacties met de stationaire fase.
• De chemische interacties bepalen de mate van migratie en scheiding van de componenten in de sample.
• Moleculen met sterkere interacties met de stationaire fase elueren minder snel en hebben een langere retentietijd.
• De stationaire fase in RP-HPLC is non-polair; de mobiele fase is polair.
• Meer polaire componenten elueren eerst omdat ze de mobiele fase prefereren.
• Vuistregel: "Like dissolves like".

Veelvoorkomende Stationaire Fasen in RP-HPLC

• Veel voorkomende stationaire fasen in RP-HPLC zijn C18, C8, C4, cyano, fenyl en amino.
• Hydrofobiciteit neemt af en de polariteit neemt toe van C18 naar amino.
• Retentie van non-polaire analyten neemt toe van amino naar C18.

Detectoren in HPLC

• Detectoren bestaan uit een flow cel waar de mobiele fase en de gescheiden samples doorheen bewegen.
• Optiek schijnt door de detector cel en variaties in optische eigenschappen worden gedetecteerd.
• Een UV-detector detecteert absorptie van UV-licht door chromoforen in de analyt.
• Een Refractieve Index detector detecteert variaties in de brekingsindex van de mobiele fase stroom.
• Een Fluorescentie detector controleert op fluorescentie.
• Detectoren geven een respons in millivolt, die door integratiesoftware wordt verwerkt tot een chromatogram.