Genética Humana: Genealogía y Diagnóstico Molecular

Contenidos

• Genética Humana
• Genealogía
• Citogenética
• Genética Molecular

Objetivo General

• El estudiante se familiarizará con los conceptos básicos de Genética Humana
• Comprender y analizar la herencia y la variación por medio de herramientas genealógicas, citogenéticas y moleculares aplicables al diagnóstico médico actual

Objetivos Específicos

• Identificar individuos no penetrantes en genealogías de herencia dominante
• Identificar portadores sanos en genealogías de herencia recesiva
• Interpretar resultados obtenidos por medio de FISH con sondas monolocus
• Combinar estrategias diferentes en la investigación de una anomalía cromosómica
• Interpretar resultados de una genotipificación por medio de PCR
• Deducir los aminoácidos codificados por una secuencia de ADN en base al código genético

Introducción

• Antes de que se descubriera la naturaleza del material responsable de la herencia en los seres vivos, la Genética intuyó que los rasgos observables (fenotipo) resultaban de la acción de los genes (genotipo) condicionado por el ambiente
• El ambiente también puede causar cambios en los genes (mutaciones) e imitar rasgos genéticamente determinados (fenocopias)

Paradigma Fundamental de la Genética

• Los rasgos observables o fenotipo resultan de la acción de los genes o genotipo condicionados por el ambiente.
• El ambiente puede causar mutaciones e imitar rasgos genéticamente determinados como fenocopias.

Teoría Cromosómica de la Herencia

• El desarrollo de la teoría cromosómica de la herencia se enriqueció con las observaciones sobre el comportamiento del material genético humano durante el ciclo celular, en particular su segregación meiótica
• Se habilitó la comprensión de los patrones que presentan nuestras herencias monogénicas y sus irregularidades

Patrones Genealógicos Reconocibles

• HAD (Herencia Autosómica Dominante)
• HAR (Herencia Autosómica Recesivo)
• HLXD (Herencia Ligada al X Dominante)
• HLXR (Herencia Ligada al X Recesivo)
• HLY (Herencia Ligada al Y)
• HM (Herencia Mitocondrial)

A. Cariotipos Humanos Normales

• Femenino y masculino

B. Segregación de los genes

• Genes autosómicos (esferas)
• Genes ligados al X y al Y
• Genes mitocondriales (óvalos) en los gametos

Tabla I: Patrones Genealógicos de las Herencias Monogénicas Humanas

• Línea de transmisión (vertical, horizontal, oblicua)
• Número de generaciones afectadas (sucesivas o alternas)
• Proporción de hermanos comprometidos
• Proporción de mujeres y varones afectados
• Presencia de portadores sanos
• Vía de transmisión al varón
• Herencia desde el varón

Tabla II: Irregularidades Genealógicas y sus Mecanismos de Composición

• Coexistencia de afecciones genéticas (heterogeneidad de locus)
• Expresividad variable (contexto, inactivación del X, heteroplasmia)
• Fenocopia (acción del ambiente)
• Esporadicidad (mutación dominante fresca o somática, rasgo recesivo que afecta a un solo miembro de la hermandad)
• Esterilidad familiar (yatrogenia reproductiva)
• Indemnidad feno y genotípica de los hijos de dos progenitores afectados por un rasgo recesivo (doble heterocigosidad)
• Indemnidad feno y genotípica de progenitores con varios hijos afectados (mosaicismo gonadal para una mutación fresca)
• Letalidad en hemicigosis con muerte prenatal de varones (nulisomía funcional parcial por mutación amórfica)
• Penetrancia incompleta (contexto, inactivación del X, heteroplasmia)
• Pseudodominancia (unión de un homocigota recesivo o hemicigota con un heterocigota)

Descubrimiento clave en la Genética

• La identificación de las moléculas responsables de la génesis de los rasgos y sus roles en los años 50 posibilitó avances científicos que permiten modificar selectivamente el material genético

Dogma Fundamental de la Genética Molecular

• ADN -> ARN -> Proteína (Retrotranscripción)
• Transcripción y Traducción
• Duplicación

El Material Genético Humano

• Incluye fundamentalmente ADN, ARN y proteínas
• Sobre este se imprimen marcas epigenéticas que lo modifican sin alterar su secuencia

ADN

• Polímero con estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria
• El ADN es el mismo en todas las células, excepto diferencias atribuibles a heteroplasmia, quimerismo, mosaicismo, reordenamiento genómico y la recombinación y segregación meióticas en los gametos

ARNm y las Proteínas

• En cambio, no son los mismos en todas las células
• Las especies presentes en una determinada célula dependen de los múltiples factores que condicionan la expresión de sus genes

Metilación del ADN

• Las marcas epigenéticas que corresponden a impronta genómica

Herencia del ADN

• Se hereda ya sea que integre un cromosoma nuclear lineal o la dotación mitocondrial de ADN circular.
• Se replica de manera semiconservativa para pasar a las células o mitocondrias hijas.

Síntesis Semiconservativa

• Se entiende que cada cadena nueva de ADN se forma incorporando nucleótido a nucleótido conforme a complementariedad con una cadena antiparalela preexistente
• La polimerización progresa en sentido 5' a 3' de la nueva cadena
• La secuencia resultante se escribe de izquierda a derecha en el sentido de su síntesis, siendo innecesario hacerlo con su complementaria

Cromosomas Nucleares y ADN Mitocondrial

• Cada cromosoma nuclear y cada anillo de ADN mitocondrial constan de una o dos moléculas bicatenarias de ADN
• Usualmente, los cromosomas nucleares integran pares homólogos –excepto por las regiones no homólogas del X y el Y–
• Miembros de un par provienen de un progenitor distinto, y difieren entre sí en cada sitio de heterocigosidad
• Los anillos de ADN mitocondrial pueden dar lugar a heteroplasmia

Cantidad de ADN por Célula

• Una célula somática en G0 o G1 tiene 46 moléculas de ADN nuclear
• Cada una de varias decenas a varios cientos de millones de pares de nucleótidos
• Un anillo de ADN mitocondrial normal tiene solamente 16569 pares de nucleótidos

ARN

• Cada molécula de ARN es en principio monocatenaria
• Se sintetiza incorporando nucleótido a nucleótido conforme a complementariedad con una secuencia antiparalela de ADN que le sirve de molde
• La síntesis progresa siempre desde el extremo 5' hacia el extremo 3' del ARN naciente, y se escribe de izquierda a derecha en el mismo sentido

Tipos de ARN

• ARNm: lleva la información codificada para la síntesis de una molécula de proteína desde el ADN hasta los ribosomas
• ARNt: aporta los aminoácidos individuales para ello
• ARNr: forma parte del organoide efector del proceso

Estudios del ARN

• Debido a su tamaño relativamente reducido, el ARN puede ser estudiado sin necesidad de dividirlo previamente
• A veces es necesario retrotranscribirlo primero en ADN complementario (ADNc)

Dotación del ARN

• Incluye especies comunes a todas las células y otras que no lo son: regulados cuya expresión depende del tipo de célula, grado de diferenciación, especialización funcional o situación metabólica

Proteínas

• La información codificada en el ARNm es traducida por los ribosomas en polipéptidos discretos o cadenas individuales de aminoácidos unidos entre sí por uniones peptídicas
• Tiene un extremo NH2 (amino) terminal colineal con el extremo 5' del ARNm y un extremo COOH carboxilo terminal
• Los 20 aminoácidos que se encuentran en nuestras proteínas, algunos podemos sintetizarlos pero los esenciales necesitamos incorporarlos con la dieta

Tabla III: Aminoácidos Esenciales y No Esenciales

• Se muestra su notación internacional de tres y una letra

Ingreso de Aminoácidos al Ribosoma

• Cada aminoácido ingresa al ribosoma esterificado mediante su carboxilo al OH del extremo 3' de un ARNt.
• Interacción de cada trinucleótido o codón de ARNm con un triplete homólogo o anticodón ubicado en el ARNt, en función de complementariedad de bases y antiparalelismo.

Flexibilidad en la Interacción

• Existiría una cierta flexibilidad (tambaleo, wobble) en la interacción entre las bases del tercer nucleótido del codón y primer nucleótido del anticodón que permite que aminoacil ARNts diferentes tengan el mismo anticodón y puedan interactuar con un codón distinto.

Unión Codón-Anticodón

• G en 5' del anticodón podía aparearse con C o U en 3' del codón.
• U en 5' del anticodón podía aparearse con A o G en 3' del codón.
• I (inosina) en 5' del anticodón podía aparearse con A, C o U en 3' del codón.

Variedad de Proteínas

• Es mayor que la que presenta su dotación de ARN
• A la que resulta directamente de esta, debe sumarse la generada mediante procesamiento postraduccional

Código Genético

• Se llama de esta forma a la clave que permite predecir qué evento de incorporación de aminoácido, iniciación o terminación de la síntesis corresponderá a cada codón del ARNm
• Secuencias correspondientes de ADN, ARNm y proteína son colineales
• De los 64 codones posibles, uno codifica metionina incluyendo la que comienza la síntesis, tres terminación y 60 los demás aminoácidos

Hipótesis del Tambaleo

• Explicaría esta “degeneración” (redundancia) del código genético nuclear y más la aun la del mitocondrial, ya que solo la metionina y el triptófano cuentan cada uno con un solo codón, mientras que los demás aminoácidos tienen hasta seis

Microorganización de los Genes

• Mayoría de los genes humanos que codifican proteínas tienen la información correspondiente “fragmentada” en exones
• Exones son secuencias de ADN representadas en las proteínas, separados por secuencias de ADN que no lo están, o intrones.
• Parte importante del proceso de expresión de los genes es la eliminación de los intrones, la cual ocurre durante el procesamiento del transcripto primario que da lugar al ARNm

Eliminación de Intrones y Empalme de los Exones

• Se lleva a cabo durante el procesamiento del transcripto primario
• La colinearidad que permite inferir la secuencia de aminoácidos de una proteína a partir de las secuencias de ADN o de ARN correspondientes involucra solo a exones

Expresión de los Genes

• El inductor provoca la dimerización y activación del receptor en la membrana celular.

• Su ingreso activa un factor de transcripción que se halla en el citoplasma.

• El factor de transcripción activado pasa al núcleo, y previa descompactación de la cromatina से une a una secuencia regulatoria específica en el ADN.

• Sigue la iniciación de la transcripción acoplada al encapuchamiento del extremo 5' del ARN en formación.

• El transcripto primario es procesado a medida que se sintetiza, con lo cual se eliminan los intrones y empalman los exones para dar lugar al ARN maduro.

• Sintetizado el extremo 3', se produce su clivado y poliadenilación.

• EI ARN maduro se une a proteínas antes de pasar al citoplasma.

• Allỉ el ARNm es traducido por los ribosomas.

• La proteína es transportada al compartimiento de destino, donde se pliega

Técnicas de Estudio Aplicables al Diagnóstico Médico en Genética Humana

• Técnicas genealógicas, para estudiar la historia familiar para identificar las manifestaciones fenotípicas
• Técnicas citogenéticas, citogenético-moleculares y moleculares: analizan el material genético tratando de vincular el fenotipo anormal hallado con una anomalía cromosómica numérica, exceso o defecto de un fragmento o con una alteración que afecte a un solo o pocos nucleótidos

Genealogía Médica

• Se utiliza cuando la ocurrencia familiar de una afección permite sospechar una anomalía hereditaria
• Esta hipótesis se puede confirmar o refutar por medio del análisis de la segregación
• Para confeccionar el árbol genealógico se requiere el estudio de la historia familiar
• Hay que utilizar correctamente los símbolos comunes, que permiten sistematizar la información

Símbolos Genealógicos Comunes

• Propósito
• Varón
• Mujer
• Sexo no especificado
• Embarazos en curso
• Muerto, aborto, mortinata
• Gemelos mono y dicigóticos
• Hermandad
• Afectados
• Portador -HAR o HLXR-
• Matrimonio
• Matrimonio consanguíneo

Instructivo para Confeccionar un Árbol Genealógico

• Simbología de uso común
• Miembros por generación a la misma altura
• Símbolos del mismo tamaño, excepto los individuos aún por nacer o abortados
• Ubicar al padre a la izquierda y ordenar a los hermanos de mayor a menor comenzando desde la izquierda
• Si alguien no se puede ordenar correctamente entre sus hermanos señalar correctamente en la línea de hermandad
• Numerar generaciones con números romanos, y miembros con arábigos
• Enunciar en las referencias la enfermedad o enfermedades
• Registrar la historia familiar

Pautas para Confeccionar un Árbol Genealógico

• En los casos de herencia monogénica, el árbol genealógico permite inferir cómo se transmite un rasgo familiar a través de las generaciones
• Si la afección es esporádica no está indicado confeccionar el árbol genealógico, pero si es familiar sí cabe hacerlo
• Si la afección compromete por lo menos a tres generaciones sucesivas, puede ser dominante
• Si afecta varones y mujeres y hay transmisión de varón a varón, es autosómica
• Si afecta solo a varones y mujeres y no hay transmisión de varón a varón, puede ser ligada al X
• Si afecta a varones y mujeres y solo las mujeres la transmiten, significa que puede ser mitocondrial
• Si afecta a varones exclusivamente, puede ser ligada al Y
• Si no compromete a varones o los mata antes de nacer, puede ser ligada al X
• Si afecta individuos de la misma generación (línea horizontal), puede ser autosómica
• Si los afectados son mayoritariamente varones vinculados con mujeres mayoritaria o exclusivamente no afectadas, entonces puede ser ligada al X

Hay que tener Presente

• Este es un lineamiento para confeccionar árboles, pero la genealogía permite plantear hipótesis
• Todas necesitan demostración

Herramientas de Citogenética y Citogenética Molecular Médicas

• Permiten estudiar mitología, y detectar anomalías de no menos de 3Mb

Identificación Citológica

• Cada cromosoma divisional humano y hasta cierto punto cada segmento
• A través de técnicas de bandeo o sondas apropiadas
• El uso de interfase es útil

Tipos de Análisis Citogenéticos

• A - Núcleo interfásico teñido con isotiocianato de fluoresceína (FITC)
• B - Cariotipo con bandeo G
• C - Núcleo interfásico hibridado con una sonda multilocus para cromosoma 21
• D - Cariotipo espectral (SKY) hibridado con sondas multilocus para cada cromosoma
• E - Cariotipo con bandeo multicolor (M-banding) por hibridación con sondas apropiadas
• F - Cromosomas analizados con sondas monolocus de cromosoma 15 para SNRPN -marcador de la región involucrada en los síndromes de Prader-Will y Angelman-, un marcador centromérico y otro telomérico

Tabla IV: Aplicabilidad, Requerimientos y Limitaciones de Técnicas Citogenéticas y Citogenético-Moleculares

• Tinción con isotiocianato de fluoresceína: Interfase; No Cultivo; No Hibridación; Sí Fluorescencia; No reordenaciones intracromosómicas.
• Bandeo G: Metafase; Sí Cultivo; No Hibridación; No Fluorescencia; Sí reordenaciones intracromosómicas.
• FISH Monolocus: Interfase; No Cultivo; Sí Hibridación; Sí Fluorescencia; No reordenaciones intracromosómicas.
• Cariotipeado Espectral: Metafase; Sí Cultivo; Sí Hibridación; Sí Fluorescencia; No reordenaciones intracromosómicas.
• Bandeo Multicolores: Metafase; Sí Cultivo; Sí Hibridación; Sí Fluorescencia; Sí Reordenaciones Intracromosómicas.
• FISH Sondas Monolocus: Metafase; Sí Cultivo; Sí Hibridación; Sí Fluorescencia; Sí Reordenaciones Intracromosómicas.

Tabla V: Aberraciones Cromosómicas Numéricas y Estructurales y sus Mecanismos de Producción

• Numéricas: Poliploidías (Triploidias), Aneuploidías (Monosomías y Trisomías).
• Estructurales: Intracromosómicas y Intercromosómicas (Anillos, Deleciones, Duplicaciones, Isocromosomas y Translocaciones).

Nomenclatura Citogenética

• Lo citogenetistas humanos han priorizado la estandarización de la nomenclatura y acompañado cada hito
• El cariotipo de una célula puede representarse gráficamente ordenando los cromosomas de una metafase, o simbólicamente
• La trisomía 21 en una mujer se simboliza detallando el número total de cromosomas
• Una trisomía en una mujer con 47 cromosomas se designa como: 47,XX,+21
• Separando los tres componentes con comas y sin espacios libres

Anomalías Estructurales

• Requieren especificar también el tipo de anomalía, el o los cromosomas afectados, y el o los sitios de corte, encerrando a unos y otros entre paréntesis, y separando mediante punto y coma si hay más de un cromosoma o segmento involucrado

Recursos para el Diagnóstico Molecular

• Se estudian con recursos moleculares, ya sea que ellos permitan estudiar un blanco a la vez, ya sea que hagan posible analizar múltiples blancos

Amplificación

• Eleva selectivamente el número de copias de un blanco y permite detectarlo
• La técnica más empleada es la termoamplificación cíclica (PCR) de ADN genómico, utilizando un par de cebadores para definir cada amplicón de interés

Exploración con Sondas

• Es el uso de fragmentos monocatenarios de ADN genómico o ADNc como sondas para detectar un blanco de ADN o ARN previamente desnaturalizado

Proteínas

• Las proteínas se reconocen mediante otros tipos de moléculas afines, como por ejemplo anticuerpos
• Técnicas clásicas en la Genética Molecular que utilizan sondas marcadas y en suspensión para investigar macromoléculas fijadas en membranas.
• Se las denomina técnicas de blotting, y a sus productos blots

Tabla VI: Técnicas de Blotting

• Macromoléculas: ADN, ARN, Proteínas
• Preparación: Enriquecimiento, Fragmentación, Desnaturalización
• Separación: Electroforesis con capilares
• Transferencia: Capilar, Electrotransferencia
• Sondas: ADNc, Oligonucleótidos y Anticuerpos
• Detección: Radioactividad, Luminiscencia y Cromogénesis

Alternativas

• Múltiples sondas dispuestas bidimensionalmente en un soporte sólido, para estudiar o no ADN genómico, ADNc resultante de retrotranscribir el ARNm o proteína de idéntico origen ya pre marcados
• Así se originan las micromatrices

Secuenciación

• Permite conocer directamente la estructura primaria o secuencia del ADN, ARN previamente retrotranscrito o no

Secuenciación Mediante Bisulfito

• Bisulfito convierte metilcitosinas pretratadas en citosinas, pero las citosinas no metiladas son reemplazadas por uracilos y replicadas como timinas

Investigación de Variantes Moleculares

• Las variantes subcromosómicas extensas pueden detectarse hibridando una micromatriz cromosómica o de SNPs alterando copias de una o más secuencias blanco

Tipos de Sustituciones

• Las sustituciones se clasifican en transiciones, cuando implican reemplazo de una base por otra con el mismo número de ciclos, y transversiones, cuando el número de ciclos de las bases involucradas es diferente

Transiciónes vs Transversiónes

• En las transiciones se remplazan purinas por purinaas, o pirimidinas por pirimidinas
• En las transversiones se remplazan purinas por pirimidinas o vice versa

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