หลักการกรอง (Filtration) และ Ultracentrifuge

เทคนิคการแยกสารเชิงวิเคราะห์

• เอกสารประกอบการสอนนี้เกี่ยวกับเทคนิคการแยกสารเชิงวิเคราะห์ โดย อ.ดร.จุฬาลักษณ์ น้อยพ่วง จากภาควิชาเทคนิคการแพทย์ คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏบ้านสมเด็จเจ้าพระยา

เทคนิคการแยกสารเบื้องต้นในห้องปฏิบัติการทางคลินิก

• เทคนิคการแยกสารพื้นฐานที่ใช้ในห้องปฏิบัติการคลินิก ได้แก่ การกรอง (Filtration), การ dialysis, และการปั่นเหวี่ยง (Centrifuge)

บทนำ

• ในงานเคมีคลินิก ตัวอย่างจากผู้ป่วยมักประกอบด้วยเลือดครบส่วน ปัสสาวะ สารน้ำ และสารคัดหลั่งต่างๆ

• สำหรับการตรวจทางเคมีคลินิก ส่วนใหญ่มักใช้ส่วนใส (supernatant) เช่น ในเลือดครบส่วนต้องปั่นแยก serum หรือ plasma ก่อน

• สำหรับปัสสาวะหรือสารคัดหลั่งอื่นๆ จะมีขั้นตอนการปั่นเพื่อแยกตะกอน(pellet) ออก

• ในงานวิจัย การแยกส่วนประกอบต่างๆ ของตัวอย่างเลือดต้องใช้ขั้นตอนที่ซับซ้อนขึ้น เช่น การปั่นแยก lipoprotein ชนิดต่างๆ หรือการแยก albumin จากโปรตีนรวมใน plasma เพื่อนำไปทดสอบวิจัย

• หากเลือกใช้วิธีการแยกไม่เหมาะสม อาจมีสารปนเปื้อน (interferences) ปนมากับสารตัวอย่าง โดยเฉพาะสารที่รบกวนสูตรโครงสร้างหรือรบกวนการเกิดปฏิกิริยาตรวจวัดของสาร analytes ทำให้ผลตรวจวัดผิดพลาด เช่น การมีเม็ดเลือดแดงปะปนใน plasma ทำให้ค่า bilirubin สูงขึ้น (ผลบวกปลอม)

เทคนิคการแยกสาร (Separation Techniques)

• Separation techniques คือ วิธีการทาง physical methods ที่อาศัยหลักความแตกต่างทางคุณสมบัติทางกายภาพของสาร เพื่อแยกองค์ประกอบของสารออกจากสารผสม (mixtures)
• บางครั้งการแยกสารหนึ่งอย่างอาจต้องใช้วิธีการหลายอย่างร่วมกันหรือทำซ้ำหลายครั้ง เพื่อให้ได้สารที่ต้องการตรวจสอบที่มีความบริสุทธิ์สูงสุดและมีการปนเปื้อนของสารรบกวนน้อยที่สุด
• ตัวอย่างเช่น การแยกเซลล์เพาะเลี้ยงเพื่อนำมาทดสอบ

ประเภทของเทคนิคการแยกสาร

• วิธีการแยกสารสามารถแบ่งตามหลักการแยกสารได้ดังนี้
• การกรอง (Filtration)
• การระเหยแห้ง (Evaporation)
• การกลั่น (Distillation: Simple and Fractional)
• การปั่นเหวี่ยง (Centrifugation)
• ไดอะไลซิส (Dialysis)
• โครมาโทกราฟี (Chromatography)
• การแยกโดยใช้แรงดึงดูดแม่เหล็ก (Magnetic Attraction/Separation)
• การตกผลึก (Crystallization)
• การแยกของเหลวที่ไม่ผสมกัน (Separating immiscible liquids)

การกรอง (Filtration)

• หลักการของ filtration และ dialysis คือการใช้ความแตกต่างของขนาดอนุภาคของสาร โดยอาศัยแผ่นเยื่อกั้นที่มีรูพรุน (porous membrane) เรียกว่า filter
• ในการแยกสารขนาดต่าง ๆ สารที่มีขนาดเล็กกว่ารูพรุนจะลอดผ่านกระดาษไปได้ แต่สารที่มีขนาดใหญ่กว่าจะติดอยู่ในสารละลายเดิม
• สารละลายที่ลอดผ่านการกรองเรียกว่า filtrate

วัสดุที่ใช้ผลิต filter membrane

• วัสดุที่ใช้ทำ Filter มักเป็นสารจำพวกกระดาษ, เซลลูโลส, หรือพลาสติก เช่น polyester
• นอกจากนี้ยังมี filter ที่ทำจาก Glass Microfiber หรือ Quartz Filters ซึ่งมีข้อดี-ข้อเสียต่างกันตามลักษณะการใช้งาน
• ตัวอย่างวัสดุและการใช้งาน:
• Cellulose Nitrate Membranes: ใช้กรองงานวิเคราะห์ Nucleic Acid และ Protein Analysis
• Cellulose acetate membrane: ใช้กรองงานวิเคราะห์ Nucleic Acid และ Protein Analysis สามารถทนความร้อนได้ 180 °C จึงเหมาะกับการกรอง hot gases
• Nylon membranes: สามารถ autoclaved ที่ 121 °C เหมาะสำหรับงานกรองที่ต้องการ sterilized
• Polyamide membrane filters: ทนต่อตัวทำละลาย organic solutions เหมาะกับการกรองยาหรือสารที่ละลายในไขมัน
• Glass microfiber filters: ทนความร้อนได้สูงถึง 500°C เหมาะสำหรับกรองสารระเหยที่ติดไฟง่าย
• High-purity quartz (SiO2) microfiber: สำหรับกรองสารระเหยที่เป็นกรด-ด่างหรือก๊าซกัดกร่อน

สรุปการเลือกใช้ฟิลเตอร์ (Filter) ตามชนิดตัวอย่าง

• Aqueous (สารละลายในน้ำ):

• Cell Culture Media: PES (Polyethersulfone)

• General Purpose Microbiology: Nitrocellulose

• Particle Analysis Microbiology: Mixed Cellulose Ester

• Particle Analysis SEM Epifluorescence: Track-Etched

• General Purpose Filtration, Low Protein Binding Applications: Cellulose Acetate/PVDF (Polyvinylidene Fluoride)

• Solvents (ตัวทำละลาย):

• Non-polar (Hydrophobic): PTFE (Polytetrafluoroethylene)

• Polar (Hydrophilic): Nylon

• Solvent Mixtures: PTFE (Polytetrafluoroethylene) หรือ Mixed Cellulose Ester

• นอกจากการใช้ filter ในการแยกสารแล้ว ห้องปฏิบัติการทางการแพทย์ยังใช้ filter เพื่อการทำลายเชื้อสารละลาย (sterilize) โดยเฉพาะสารที่ไม่สามารถใช้ความร้อนสูง (autoclave) เช่น ยาหรืออาหารเพาะเลี้ยงเชื้อ

ขนาดรูพรุนของ Membrane Filters และการใช้งาน

• Pore size (μm):
• 5: Microbes ที่ถูกกักไว้: Multicellular algae, animals, and fungi
• 3: Yeasts and larger unicellular algae
• 1.2: Protozoa and small unicellular algae
• 0.45: Largest bacteria
• 0.22: Largest viruses and most bacteria
• 0.025: Larger viruses and pliable bacteria (mycoplasmas, rickettsias, chlamydias, and some spirochetes)
• 0.01: Smallest viruses

การเลือกใช้ filter ชนิดต่างๆ

• ข้อสำคัญ: ต้องเลือกใช้ Filter papers ให้เหมาะสมกับวัตถุประสงค์การใช้งาน(ทราบก่อนว่าต้องการกรองสารประเภทใด)

• หากต้องการกรองสารปริมาณมากๆ ควรใช้ filter ที่มีขนาดใหญ่

• หากต้องการปลอดเชื้อสารละลาย ควรเลือกใช้ filter ที่มี pore size ขนาดเล็

• ตัวอย่าง:

• ต้องการเตรียมสารละลาย buffer และกรองตะกอนออก เพื่อการทดลองทั่วไป สามารถใช้ filter กระดาษธรรมดาขนาดใหญ่พับเป็นทบให้มีขนาดพอดีกับ funnel

• หากต้องการกรองสารเคมีหรือยาที่ละลายในตัวทำละลาย(Detergent หรือ organic solvent) ควรเลือกใช้ filter ที่มีความทนทานต่อสารละลายประเภทนั้น(polyamide membrane)

• ไม่ควรใช้ Filter paper กรอง กรดหรือเบสแก่ หรือสารใดๆ ที่มีคุณสมบัติกัดกร่อน (กระดาษ filter มักขาด)

ไดอะไลซิส(Dialysis)

• หลักการ: สารละลายที่ต้องการแยกจะถูกบรรจุในถุงที่มีคุณสมบัติเป็นเยื่อเลือกผ่าน (semipermeable membrane) สารที่มีขนาดเล็กกว่ารูเท่านั้นที่สามารถแพร่ผ่านรูออกมาสู่สารละลายภายนอกได้
• สารที่มีขนาดโมเลกุลใหญ่กว่ารูเยื่อจะไม่สามารถผ่านออกมาได้ ทำให้ในถุงจะมีแต่สารโมเลกุลใหญ่เท่านั้น
• Kidney dialysis หรือ Renal dialysis (การฟอกไต): เป็นการกรองเอาของเสียขนาดเล็ก (เช่น urea หรือ ammonia) ออกจากเลือด โดยที่สารขนาดใหญ่ (เช่น โปรตีน) จะไม่สามารถผ่านการกรองได้ เครื่องจะส่งโปรตีนกลับเข้าสู่ร่างกาย

ข้อจำกัดของวิธี Dialysis:

• ขั้นตอนดังกล่าวใช้ระยะเวลานาน ในปัจจุบันได้มีการพัฒนาจากการใช้ถุงเซโลเฟน มาเป็นการใช้ Cassette หรือมีการพัฒนาเยื่อเลือกผ่านโดยใช้วัสดุจำพวก gel แทน เพื่อเพิ่มความคงทนและความเร็วในการกรอง แต่วิธีนี้ก็ยังไม่ได้รับความนิยมในงานตรวจวิเคราะห์ทางเคมีคลินิกเท่าที่ควร

Centrifuges (เครื่องปั่นเหวี่ยง)

• เทคนิคที่นิยมใช้ในการแยกสารหรืออนุภาคในห้องปฏิบัติการทางการแพทย์ คือ การปั่นเหวี่ยงตกตะกอน โดยเฉพาะห้องปฏิบัติการเคมีคลินิก

• สิ่งส่งตรวจหลักที่ทำการตรวจวิเคราะห์มักเป็น serum หรือ plasma ดังนั้นเมื่อรับตัวอย่างเลือดหรือสารน้ำจากผู้ป่วยมาแล้ว จะเข้าสู่ขั้นตอนการแยกนำเฉพาะส่วนน้ำเช่น serum หรือ plasma ออกจากเซลล์เม็ดเลือด นอกจากนี้ยังใช้การปั่นเหวี่ยงตกตะกอนในกรณีอื่นๆ อีกเช่น

• หากสิ่งส่งตรวจขุ่นหรือมีตะกอนมาก อาจเป็นปัญหารบกวนการตรวจวิเคราะห์ สามารถปั่นเพื่อขจัดตะกอนก่อน แล้วนำเฉพาะส่วนน้ำใส supernatant ไปตรวจวิเคราะห์ต่อไป

• การปั่นเพื่อแยกชั้นของเหลว 2 ชนิด: ตัวอย่างเลือดที่มีปริมาณไขมันมาก (lipid-laden sample) ต้องทำการขจัดไขมันส่วนเกินทิ้งก่อนเก็บ serum หรือ plasma ไปตรวจวิเคราะห์ต่อไป

• เทคนิค Centrifugation เป็นการแยกสารหรืออนุภาค โดยใช้แรงเหวี่ยงหนีจุดศูนย์กลาง (centrifugal force)

• ใช้แยกอนุภาคที่ไม่ละลายออกจากของเหลว หรือใช้แยกของเหลวหลายชนิดที่มีความถ่วงจำเพาะต่างกัน โดยอาศัยความแตกต่างระหว่างความหนาแน่นและขนาดของสาร

• ภายใต้แรงหนีศูนย์กลาง สารหรืออนุภาคต่างๆ จะตกตะกอนด้วยอัตราเร็วที่ไม่เท่ากัน เครื่องที่ทำหน้าที่สร้างแรงเร่งหนีศูนย์กลางนี้เรียกว่า เครื่องปั่นตกตะกอนหรือ Centrifuge

หลักการพื้นฐานของการตกตะกอน (Basic Principles of Sedimentation)

• ในสภาวะปกติ เมื่อตั้งสารละลายทิ้งไว้ สารที่ไม่ละลายจะเกิดการตกตะกอนเนื่องจากแรงโน้มถ่วงของโลก (earth's gravitational field) (g = 981cm s⁻²) ดึงให้ตกสู่โลก
• หากต้องการให้ตะกอนตกเร็วขึ้น:
  • เพียงเพิ่มแรงดึงให้มากกว่าแรง g (g >981 cm s⁻²) โดยใช้ แรงหนีจุดศูนย์กลาง (centrifugal field) ที่เกิดจากการแรงเหวี่ยงจากการหมุนปั่นเป็นวงกลม

แรงหนีศูนย์กลาง (Centrifugal force)

• แรง Centrifugal force เกิดจากการหมุนรอบจุดหมุน (center of rotation)

• สารที่ปะปนกันอยู่ในสารละลาย หากมีความถ่วงจำเพาะแตกต่างกันย่อมจะแยกชั้นกันออกมาในที่สุด ซึ่งแรง Centrifugal force ที่เราใส่ให้ จะส่งผลต่ออนุภาคแต่ละชนิดไม่เหมือนกัน (มันเลยแยกชั้นกันได้)

• อย่างไรก็ตาม แรงนี้หากจะทำให้อนุภาคเคลื่อนที่ตกตะกอนได้นั้นก็จะต้องมีค่ามากกว่าแรงต้านการตกตะกอน ซึ่งสำหรับการปั่นตกตะกอนสารละลายแล้วมีแรงต้านที่ต้องคำนึงถึงอยู่ 2 ค่าคือ

• Buoyant force (แรงลอยตัวหรือแรงพยุง): เป็นแรงต้านการแทนที่หรือแรงกดจากของเหลวเบื้องล่างด้วยวัตถุที่อยู่ชั้นบน

• Frictional force(แรงเสียดทาน): เป็นแรงเสียดสีที่วัตถุกระทบกัน มีผลต้านการเคลื่อนที่ไปข้างหน้า

สรุปปัจจัยที่มีผลต่อการตกตะกอน:

• Buoyant force: ยิ่งสารมีความหนืด/ความเข้มข้นมากเท่าใด จะทำให้อนุภาคเคลื่อนตัวตกตะกอนช้าลง
• Frictional force: ยิ่งอนุภาคมีค่าสัมประสิทธิ์ของความเสียดทานมาก อนุภาคจะเคลื่อนตัวตกตะกอนช้าลง แรงเสียดทานของวัตถุหนึ่งๆ จะเท่ากับความเร็วในการเคลื่อนที่ของอนุภาคคูณด้วยค่าสัมประสิทธิ์ของความเสียดทาน โดยที่ปัจจัยที่มีอิทธิพลต่อค่าสัมประสิทธิ์ของความเสียดทานได้แก่ ขนาดและรูปร่างของอนุภาค
• ยิ่งอนุภาคมีความหนาแน่นมาก/ความถ่วงจำเพาะสูง การตกตะกอนจะเร็วขึ้น (ค่าสัมประสิทธิ์น้อย)
• ยิ่งอนุภาคมีมวลมาก การตกตะกอนจะเร็วขึ้นด้วยเช่นกัน (ค่าสัมประสิทธิ์น้อย)
• Centrifugal force: ยิ่งเพิ่มแรง centrifugal force มาก การตกตะกอนก็ยิ่งเร็วมากขึ้น

อัตราการตกตะกอน (The rate of sedimentation)

• อัตรานี้มักแปรผันตรงกับค่าแรงหนีจุดศูนย์กลางที่ใส่เข้าไปในระบบ (g :cm*s⁻²) สามารถคำนวณได้จากสูตร: G = ω²r
  • โดยที่ r คือระยะทางที่อนุภาคเดินทาง ซึ่งก็คือระยะรัศมีของการปั่นวัดจากแกนหัวปั่นถึงรองหลอดที่ปั่น (หน่วยเป็น cm)
  • ω คือค่า angular velocity ของหัวปั่น (หน่วยเป็น radians per second)
• ตัวอย่าง: หากค่า angular velocity ของหัวปั่นคือ 3000 rad/วินาที และปั่นสารที่จุดซึ่งห่างจากแกนหมุน 5 cm ค่า applied centrifugal field จะเท่ากับ 4.5 x 10^7 cm/s²

การคำนวณ 2：

• Angular velocity แสดงในรูปปฏิวัติง/นาที (revolutions per minute)
• คำนวณได้ดังนี้ ω = 2π rev min-1 =G=4π² (rev min -1)² r 60 3600
• แรงหนีจุดศูนย์กลางมักแสดงเป็นจำนวนเท่าของแรงโน้มถ่วง (g)
• (981 cm⋅s -2) แทนในสูตร
• RCF* = 4π² (rev min -1)² r = 1.118 x 10-5
• 3600981**
• ค่าที่เกิดขึ้นนี้เรียกว่า Relative centrifugal field หรือ RCF เขียนในรูป “x g' หรือจำนวนเท่าของค่าแรงโน้มถ่วงนั่นเอง จะเห็นได้ว่า 4π² และ 3600981 เป็นค่าคงที่เมื่อคำนวณแปลงเป็นตัวเลขค่าหนึ่งจะเท่ากับ 1.118 × 10-5 นอกจากนี้ในส่วนของ revmin หรือ revolutions per minute สามารถเขียนเป็นตัวย่อได้ว่า “r.p.m.”

ความเร็วของเครื่องหมุนเหวี่ยง (Speed of the Centrifuge)

• ความเร็วในการปั่นหรือหมุนของหัว rotor จะวัดเป็นหน่วย รอบต่อนาที (Revolutions per minute: RPM)
• ค่าแรงเหวี่ยงหนีศูนย์กลางที่เกิดจากการหมุนหัวปั่นของ centrifuge จะเรียกว่า ค่าแรงหนีศูนย์กลางสัมพันธ์ (Relative centrifugal force: RCF) หรืออาจเรียกว่าแรงโน้มถ่วง (gravities: g) ก็ได้
• สามารถเขียนความสัมพันธ์เป็นสูตรคำนวณได้ดังนี้:
• RCF(g) = 1.118 x 10⁻⁵ x r x (rpm)²
• 1.118 × 10⁻⁵คือค่าคงที่วัดจากการคำนวณค่า angular velocity
• r คือค่ารัศมีของหัวปั่นมีหน่วยเซนติเมตร วัดตั้งแต่จากแกนกลางหัวปั่นไปถึงฐานรองก้นหลอดของ shield หรือ bucket
• RCF คือ แรงหนีจุดศูนย์กลางสัมพันธ์ มีหน่วยเป็นเท่าของค่า g
• RPM คือ อัตราความเร็วรอบ มีหน่วยเป็น รอบ/นาที
• หากทราบค่า RCF หรือรัศมีของหัวปั่น จะสามารถทราบค่า RPM ได้ ในทางกลับกันหากทราบค่า RPM ก็สามารถคำนวณค่า RCF

โครงสร้างของเครื่อง Centrifuge

• เครื่องปั่นแยกตะกอนมีโครงสร้างหลัก 4 ส่วน:
  1. มอเตอร์และอุปกรณ์ทดรอบ (Motor and Gear box)
  2. หัวปั่น (Rotor): ต่อกับส่วนแกนหมุนของมอเตอร์ สำหรับเครื่องปั่นที่กำหนดอุณหภูมิได้จะมีส่วน air compressor ด้วย
  3. ส่วนใส่สิ่งส่งปั่น (Chamber หรือ Bucket)
  4. ส่วนที่ควบคุมการทำงานของเครื่อง (control panel)

เรียนรู้หลักการพื้นฐานของการกรองโดยใช้ porous membrane, ความหมายของ filtrate, และการประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมยา นอกจากนี้ยังครอบคลุมถึงหลักการทำงานและคุณสมบัติของ ultracentrifuge รวมถึงการเลือกใช้หัวปั่น (rotor) ที่เหมาะสม.