Analytical Separation Techniques PDF

Analytical Separation Techniques อ.ดร.จุฬาลักษณ์ น้อยพ่วง Clinical chemistry 1 Medical technology department Science and Technology faculty Bansomdejchaopraya Rajabhat University เอกสารประกอบการสอน Atittaya Rocejanasaroj, Ph.D. ...

Analytical Separation Techniques อ.ดร.จุฬาลักษณ์ น้อยพ่วง Clinical chemistry 1 Medical technology department Science and Technology faculty Bansomdejchaopraya Rajabhat University เอกสารประกอบการสอน Atittaya Rocejanasaroj, Ph.D.  Outline Basic Separation techniques in clinical laboratory  Filtration Centrifuge Basic Principles  Dialysis The rate of sedimentation  Centrifuge Speed of the centrifuge Calculation of g-force Convert g-force to RPM Centrifuges structure Centrifuge classification Type of centrifuge Type of rotor Care and maintenance of centrifuges Separated techniques by centrifuges https://www.scienova.com/dialyse/ Differential centrifugation https://shop.pall.com/us/en/laboratory/venting-gas-filtration/filter-holders-membranes-1/zidgri78ld3 https://www.sigmaaldrich.com/TH/en/products/filtration/laboratory-filter-membranes/millipore-filter-membranes Density gradient centrifugation https://www.labmanager.com/product-focus/the-basics-of-centrifuge-operation-and-maintenance-1433  Introduction  ในงานทางเคมีคลินิก สิ่งส่งตรวจจากผู้ป่วยประกอบไปด้วย เลือดครบส่วน (whole blood), ปัสสาวะ, สารน้าและสารคัดหลั่งต่างๆ  ส้าหรับตัวอย่างที่ใช้ตรวจทางเคมีคลินิกส่วนใหญ่ ใช้ตัวอย่างที่เป็นส่วนใส (supernatant) เช่นเลือดครบส่วน ต้องปั่นแยก serum หรือ plasma ออกมาก่อน ส้าหรับปัสสาวะหรือสารคัดหลั่งต่างๆ ต้องมีขันตอนการปั่นเพื่อ แยก pellet ออก https://www.expresslabidaho.com/collection-tips/handling-considerations/ Tse, Ryan Tsz-Hei, et al. "Urinary Cell-Free DNA in Bladder Cancer Detection." Diagnostics 11.2 (2021): 306.  Introduction  ส้าหรับในงานวิจัย การแยกส่วนประกอบต่างๆ ของตัวอย่างเลือด ต้องใช้ขันตอนการแยกที่ซันซ้อนขึน อาทิเช่น การปั่นแยก lipoprotein ชนิดต่างๆ , การแยกเอาเฉพาะ albumin จากโปรตีนรวมใน plasma มาทดสอบวิจัยเท่านัน การแยก lipoprotein ด้วยวิธี Ultracentrifugation (แยกตาม density) เมื่อปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่องปั่นความเร็วสูง Lipoprotein ที่มีความหนาแน่นน้อย จะลอยขึนด้านบน lipoprotein ที่มีความ Chait, Alan, et al. "Remnants of the triglyceride-rich lipoproteins, diabetes, and cardio หนาแน่นสูงจะตกลงสู่ด้านล่าง vascular disease." Diabetes 69.4 (2020): 508-516. หากเลือกใช้วิธีการแยกไม่เหมาะสม อาจมีสารปนเปื้อน (interferences) ปนมากับสาร ตัวอย่าง โดยเฉพาะสารรบกวนที่มีสูตรโครงสร้างหรือรบกวนการเกิดปฏิกิริยาตรวจวัดของ สาร analytes จะทาให้ผลการตรวจวัดดังกล่าวมีความผิดพลาดไม่ตรงกับค่าที่แท้จริง เช่น การมีเม็ดเลือดแดงปะปนมากับ plasma → bilirubin (ปลอม)  Separation Techniques Separation techniques คือ วิธีการทาง physical methods ที่อาศัยหลักความแตกต่าง ทางคุณสมบัติทางกายภาพของสารหนึ่ง ๆ ในการ แยกองค์ประกอบสารนั้น ๆ ออกมาจากสารผสม (mixtures) บางครั้งขั้นตอนการแยกสารหนึ่งอาจใช้วิธีการ แยกหลายวิธีร่วมกันหรือทาซ้าหลายครั้ง → เพื่อให้ได้สารที่ต้องการตรวจสอบที่มีบริสุทธิ์สูง ที่สุดและมีการปนเปื้อนของสารรบกวนน้อยที่สุด ตัวอย่างเช่น การแยกเซลล์เพาะเลี้ยง สาหรับนามาทดสอบ http://www.intechopen.com/journals/journal-of-circulating-biomarkers/size-exclu sion-hplc-detection-of-small-size-impurities-as-a-complementary-means-for-qualit y-analysis  Types of Separation Techniques แบ่งวิธีการแยกสารออกตามหลักการแยกสารได้ดังนี้ Evaporation Filtration (การกรอง) Evaporation (การระเหยแห้ง) Distillation (Simple and Fractional) Centrifugation Chromatograph Dialysis y Chromatography Magnetic Attraction/ Separation Crystallization Separating immiscible liquids Magnetic Separation Crystallization https://faculty.uca.edu/kdooley/lab_separations.pdf Rossi, Liane M., et al. "Magnetic nanomaterials in catalysis: advanced catalysts https://www.spscience.com/17071884 for magnetic separation and beyond." Green Chemistry 16.6 (2014): 2906-2933 http://www.adareng.com/es/articulo/chromatography-main-concepts/n-7 https://sites.google.com/a/maricopa.edu/hailey18/home/chemistry/classifyingmatter  Filtration (การกรอง) หลักการ : filtration และ dialysis เป็นเทคนิคการแยกที่ใช้ความแตกต่างระหว่าง ขนาดของสสารโดยอาศัยแผ่นเยื่อกั้นมีรูพรุน (porous membrane) เรียกว่า filter ในการแยกสารขนาดต่าง ๆ ออกจากกัน กล่าวคือ เฉพาะสารที่มีขนาดเล็กกว่ารูพรุน ที่จะสามารถลอดผ่านกระดาษไปสู่อีกด้านได้ แต่ถ้าสารดังกล่าวมีขนาดใหญ่กว่าก็จะ ติดอยู่ในสารละลายเดิม โดยเรียกสารละลายที่ผ่านการกรองนี้แล้วว่า filtrate http://wps.pearsoned.ca/ca_school_ist7-8preview/99/25479/6522665.cw/content/ ตัวอย่างกระดาษส้าหรับกรองเม็ดเลือด http://www.sswm.info/content/membrane-filtration http://docshare01.docshare.tips/files/9034/90347231.pdf  Filtration (การกรอง) ตัวอย่างการแยก plasma ออกจากเลือดครบส่วนโดยใช้กระดาษส้าหรับกรองเม็ดเลือด (blood separation membrane) Songjaroen, Temsiri, et al. "Blood separation on microfluidic paper-based analytical devices." Lab on a Chip 12.18 (2012): 3392-3398.  วัสดุที่นามาใช้ผลิต filter membrane วัสดุที่นามาผลิตเป็น Filter มักเป็นผลิตจากสารจาพวกกระดาษหรือเซลลูโลส, พลาสติกเช่น polyester นอกจากนี้ ยังมี filter ที่ทาจาก Glass Microfiber หรือ Quartz Filters ด้วย ซึ่งมีข้อดี-เสียลักษณะการใช้งานแตกต่างกันไป ยกตัวอย่างเช่น Cellulose Nitrate Membranes มักใช้ในการกรองสาหรับงานวิเคราะห์ทาง Nucleic Acid และ Protein Analysis Cellulose acetate membrane มักใช้ในการกรองสาหรับงานวิเคราะห์ทาง Nucleic Acid และ Protein Analysis สามารถทนความร้อนได้ถึง 180 ºC จึงเหมาะกับการกรอง hot gases ด้วย Nylon membranes สามารถ autoclaved ที่ 121 ºC ได้ดังนั้นจึงเหมาะสาหรับงานกรองเพื่อ sterilized ต่างๆ Polyamide membrane filters มีคุณสมบัติทนต่อตัวทาละลายจาพวก organic solutions จึงเหมาะกับ การกรองยาหรือสารที่ละลายในไขมัน Glass microfiber filters สามารถทนความร้อนได้สูงถึง 500°C ดังนั้นจึงเหมาะสาหรับงานกรองสารระเหย ที่ติดไฟง่าย High-purity quartz (SiO2) microfiber สาหรับงานกรองสารระเหยที่มีฤทธิ์เป็นกรด-ด่าง หรือก๊าซกัดกร่อน  สรุปการเลือกใช้ filter ชนิดต่างๆ Polyethersulfone Polytetrafluoroethylene Polyvinylidene Fluoride Polytetrafluoroethylene นอกจากจะใช้ filter ในการแยกสารแล้ว ในห้องปฏิบัติการวิจัยทางการแพทย์ยังใช้ filter เพื่อ การทาสารละลายให้ปลอดเชื้อหรือ sterile โดยเฉพาะสารละลายที่ไม่สามารถทาให้ปลอดเชื้อด้วย ความร้อนสูง (autoclave) เช่น ยา หรือ อาหารสาหรับการเพาะเลี้ยงเชื้อ/เซลล์ Membrane Filters Pore size (m) Microbes That Are Trapped 5 Multicellular algae, animals, and fungi 3 Yeasts and larger unicellular algae 1.2 Protozoa and small unicellular algae 0.45 Largest bacteria 0.22 Largest viruses and most bacteria 0.025 Larger viruses and pliable bacteria (mycoplasmas, rickettsias, c hlamydias, and some spirochetes) 0.01 Smallest viruses http://www.spectrumlabs.com/filtration/PoreSize.html  การเลือกใช้ filter ชนิดต่างๆ ข้อสาคัญ : ต้องเลือกใช้ Filter papers ให้เหมาะสมตรงกับวัตถุประสงค์ที่การใช้งาน (ต้องทราบก่อนว่าต้องการกรองสารประเภทใด) หากต้องการกรองสารปริมาณมากๆ ควรใช้ filter ที่มีขนาดใหญ่ หากต้องการปลอดเชื้อสารละลายควรเลือกใช้ filter ที่มี pore size ขนาดเล็ก ยกตัวอย่างเช่น 1. ต้องการเตรียมสารละลาย buffer และกรองตะกอนสิ่งสกปรกเช่น ฝุ่น ออกสาหรับการทดลอง ทั่วไป (clarifying liquids) เราสามารถใช้ filter กระดาษธรรมดาขนาดใหญ่พับเป็นทบให้มี ขนาดพอกับ funnel แล้วกรองสารละลายผ่าน  การเลือกใช้ filter ชนิดต่างๆ 2. หากต้องการกรองสารเคมีหรือยาที่ละลายในตัวทาละลาย เช่น Detergent หรือ organic solvent อื่นๆ ควรเลือกใช้ filter ที่มีความทนต่อสารละลายประเภทนี้ เช่น Polyamide membrane อย่างไรก็ตาม ไม่ควรใช้ Filter paper ในการกรอง กรดหรือเบสแก่ หรือ สารใดๆ ที่มี คุณสมบัติกัดกร่อน (กระดาษ filter มักขาด) VDO http://www.tri-solution.com/Consumable/Membrane-Filter.html http://edusanjalmicro.blogspot.com/2010/07/membrane-filter-technique.html http://www.54pc.com/list/sort/1600.htm http://microbiollogy.blogspot.com/2013/03/control-of-microorganisms-by-physical_14.html  Dialysis หลักการ : สารละลายที่ต้องการแยกจะถูกบรรจุอยู่ในถุงที่มีคุณสมบัติเป็นเยื่อเลือกผ่าน (semipermeable membrane) สารที่มีขนาดเล็กกว่ารูเท่านั้นที่สามารถแพร่ผ่านรูเยื่อออกมาสู่สารละลาย ภายนอก (มักมีความเข้มข้นของสารดังกล่าวน้อยกว่า) ได้ แต่สารที่มีขนาดโมเลกุลใหญ่กว่าขนาดของรูเยื่อ (pore) จะไม่สามารถผ่านเยื่อออกมาสู่สารละลายภายนอกได้ เมื่อเวลาผ่านไปจะพบว่าภายในถุงจะมีแต่สาร โมเลกุลใหญ่เท่านั้น https://www.scienova.com/dialyse/ Kidney dialysis หรือ Renal dialysis หรือการฟอกไต เป็นการกรองเอาของเสียขนาดเล็ก เช่น urea หรือ ammonia เท่านั้นออกจากเลือด โดยที่สารขนาดใหญ่ เช่น โปรตีนจะไม่สามารถผ่านการกรอง (ด้วยเยื่อในเครื่องฟอกไต) ออกมาได้ เครื่องจะส่งโปรตีนกลับเข้าอยู่ในร่างกายเช่นเดิม http://www.renadyl.com/dialysis/dialysis-treatment-withdrawal-and-the-effects-of-treatment-on-patients-and-caregivers/  VDO ข้อจากัดของวิธี Dialysis คือ ขั้นตอนดังกล่าวใช้ระยะเวลานานในการแยกสาร ในปัจจุบันได้มีการพัฒนาจากการใช้ถุงเซโลเฟน มาเป็นการใช้ Cassette หรือมีการพัฒนาเยื่อเลือกผ่านโดยใช้วัสดุจาพวก gel แทนเพื่อเพิ่มความคงทนและความเร็วในการกรอง แต่วิธีนี้ก็ยังไม่ได้รับความนิยมในงานตรวจวิเคราะห์ทางเคมีคลินิกเท่าที่ควร  Centrifuges สาหรับเทคนิคที่นิยมในการแยกสารหรืออนุภาคในห้องปฏิบตั ิการทางการแพทย์ คือ การปั่นเหวี่ยง ตกตะกอน โดยเฉพาะห้องปฏิบัตกิ ารเคมีคลินิก สิ่งส่งตรวจหลักที่ทาการตรวจวิเคราะห์มักเป็น serum หรือ plasma ดังนั้นเมื่อรับตัวอย่างเลือดหรือสารน้าจากผู้ปว่ ยมาแล้ว → เข้าสู่ขั้นตอนการ แยกนาเฉพาะส่วนน้าเช่น serum หรือ plasma ออกจากเซลล์เม็ดเลือด นอกจากนีเ้ รายังใช้การปั่น เหวี่ยงตกตะกอนในกรณีอื่นๆ อีกเช่น  หากสิ่งส่งตรวจขุ่นหรือมีตะกอนมาก อาจเป็นปัญหารบกวนการ ตรวจวิเคราะห์ก็สามารถปั่นเพื่อขจัดตะกอนออกก่อน แล้วนา เฉพาะส่วนน้าใส supernatant ไปตรวจวิเคราะห์ต่อไป การปั่นแยกตะกอนในปัสสาวะ  การปั่นเพื่อแยกชั้นของเหลว 2 ชนิด เช่น ตัวอย่างเลือดที่มีปริมาณไขมันมาก (lipid-laden sample) จาต้องทาการขจัดไขมันส่วนเกินทิ้งก่อนเก็บ serum หรือ plasma ไปตรวจวิเคราะห์ต่อไป https://www.expresslabidaho.com/collection-tips/handling-considerations/ https://www.renalfellow.org/2019/11/06/urine-sediment-of-the-month-the-visible-sediment/  Centrifugation เทคนิค centrifugation เป็นเทคนิคการแยกสารหรืออนุภาค โดยใช้แรงเหวี่ยงหนีจุดศูนย์กลาง (centrifugal force) ในการแยกตกตะกอนของอนุภาคที่ไม่ละลายออกจาก ของเหลว หรือใช้แยกของเหลวหลายๆ ชนิดที่มีความ ถ่วงจาเพาะต่างกันออกจากกัน โดยอาศัยความแตกต่าง ระหว่างความหนาแน่นและขนาดของสารต่างๆ เนื่องจาก ภายใต้แรงหนีศูนย์กลางนี้ สารหรืออนุภาคต่างๆ จะ ตกตะกอนด้วยอัตราเร็วที่ไม่เท่ากัน ซึ่งเครื่องที่ทาหน้าที่ สร้างแรงเร่งหนีศูนย์กลาง (Centrifugal force) นี้เรียกว่า เครื่องปั่นตกตะกอนหรือ Centrifuge https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Centrifuge1.jpg https://spanish.alibaba.com/product-detail/ce-iso-approved-4x500ml-750ml-swing-out-rotor-swing-bucket-centrifuge-60768465503.html  Basic Principles of Sedimentation ในสภาวะปกติ เมื่อเราตั้งสารละลายหนึง่ ๆ ทิ้งไว้ → เมื่อเวลาผ่านไปจะพบว่า สารที่ไม่ละลายจะเกิดการ ตกตะกอน การตกตะกอนนีเ้ กิดจากแรงโน้มถ่วงของโลก (earth’s gravitational field) (g = 981cm s-2) ดึงให้ตกสู่โลก หากเราต้องการให้ตะกอนตกเร็วขึ้น = เพียงโดยการเพิ่มแรงดึงให้มากกว่าแรง g (g 981 cm s-2) ซึ่งแรงชนิดหนึ่งที่สามารถ ดัน/ผลัก อนุภาคให้ตกตะกอนได้คือ แรงหนีจุดศูนย์กลาง (centrifugal field) ที่เกิดจากการแรงเหวี่ยงจากการหมุนปั่นเป็นวงกลม VDO ตัวอย่างการตกตะกอนของสาร http://coagulant-flocculation.blogspot.com/  http://cellbiologyolm.stevegallik.org/node/74 http://www.calctool.org/CALC/phys/newtonian/centrifugal http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/centrifugation-separations.html  Centrifugal force Centrifugal force เกิดจากการหมุนรอบจุดหมุน (center of rotation) โดยสารที่ปะปนกันอยู่ในสารละลาย นั้น หากมีความถ่วงจาเพาะแตกต่างกันย่อมจะแยกชั้นกันออกมาในที่สุด ซึ่งแรง Centrifugal force ที่เราใส่ให้ จะส่งผลต่ออนุภาคแต่ละชนิดไม่เหมือนกัน (มันเลยแยกชั้นกันได้) อย่างไรก็ตาม แรงนี้หากจะทาให้อนุภาค เคลื่อนที่ตกตะกอนได้นั้นก็จะต้องมีค่ามากกว่าแรงต้านการตกตะกอน ซึ่งสาหรับการปั่นตกตะกอนสารละลาย แล้วมีแรงต้านที่ต้องคานึงถึงอยู่ 2 ค่าคือ Buoyant force หรือแรงลอยตัวหรือแรงพยุง: Frictional force หรือแรงเสียดทาน: เป็นแรงต้านการแทนที่หรือแรงกดจากของเหลว เป็นแรงเสียดสีที่วัตถุกระทบกัน เบื้องล่างด้วยวัตถุที่อยู่ชั้นบน มีผลต้านการเคลื่อนที่ไปข้างหน้า http://onebyzeroelectronics.blogspot.com/2015/10/what-is-buoyant-force.html  สามารถกล่าวสรุปได้ดังนี้ Buoyant force → ยิ่งสารมีความหนืด/ความเข้มข้นมากเท่าใด ก็จะทาให้อนุภาค เคลื่อนตัวตกตะกอนช้าลงเท่านั้น Frictional force → ยิ่งอนุภาคมีค่าสัมประสิทธิ์ของความเสียดทานมากเท่าใด ก็จะทาให้อนุภาคเคลื่อนตัวตกตะกอนช้าลงเท่านั้น แรงเสียดทานของวัตถุหนึง่ ๆ จะเท่ากับความเร็วในการเคลื่อนที่ของอนุภาคคูณด้วยค่าสัมประสิทธิ์ ของความเสียดทาน (frictional coefficient) โดยที่ปัจจัยที่มีอิทธิพลต่อค่าสัมประสิทธิข์ องความ เสียดทานได้แก่ ขนาดและรูปร่างของอนุภาค - ยิ่งอนุภาคมีความหนาแน่นมาก/ความถ่วงจาเพาะสูงเท่าใด (ค่าสัมประสิทธิ์น้อย) การตกตะกอนก็ยิ่งเร็วมากขึ้นเท่านั้น - - ยิ่งอนุภาคมีมวลมากเท่าใด (ค่าสัมประสิทธิ์น้อย) การ ตกตะกอนก็ยิ่งเร็วมากขึ้นเท่านัน้ Centrifugal force → ยิ่งเราเพิ่มแรง centrifugal force มากขึ้นเท่าใดการ ตกตะกอนก็ยิ่งเร็วมากขึ้นเท่านั้น  The rate of sedimentation อัตราการตกตะกอนของสารมักแปรผันตรงกับค่าแรงหนีจุดศูนย์กลางทีใ่ ส่เข้าไป ในระบบ (g :cm*s-2) สามารถคานวณได้จากสูตร G=2r โดยที่ r = ระยะทางที่อนุภาคเดินทาง นั่นคือระยะรัศมีของการปั่นซึ่งวัดตั้งแต่แกน หัวปั่นไปจนถึงรองหลอดที่ปั่น (หน่วยเป็น cm)  = ค่า angular velocity ของหัวปั่น (หน่วยเป็น radians per second) ตัวอย่าง : What is the applied centrifugal field at a point equivalent to 5 cm from the center of rotation and an angular velocity of 3000 rad s-1? วิธีทา จากสูตร G=2 r แทนค่า G = (3000)2 x 5 = 4.5 x 107 cm*s-1 https://www.howitworksdaily.com/what-is-centrifugal-force/  The rate of sedimentation โดยที่ค่า angular velocity หรือค่าความเร็วในการหมุนของของหัวปั่นจะแสดงในหน่วย revoluti ons (rev) per minute มีสูตรการคานวณดังนี้  = 2  rev min-1 G=2r G = 42(rev min-1)2r 60 3600 ค่าแรงหนีจุดศูนย์กลางนี้มักแสดงในหน่วยที่เป็นจานวนเท่าของค่าแรงโน้มถ่วง g (981 cm*s–2) แทนค่าเข้าไปในสูตรจะได้ว่า RPM RCF = 42(rev min-1)2r 3600 * 981 =1.118 x 10-5 ค่าที่เกิดขึ้นนี้จะเรียกว่า Relative centrifugal field หรือ RCF เขียนหน่วยในรูป ‘x g’ หรือ จานวนเท่าของค่าแรงโน้มถ่วงนั่นเอง จะเห็นได้ว่า 42 และ 3600*981 เป็นค่าคงที่เมื่อคานวณ แปลงเป็นตัวเลขค่าหนึ่งจะเท่ากับ 1.118 x 10-5 นอกจากนี้ในส่วนของ rev*min หรือ revolutions per minute สามารถเขียนเป็นตัวย่อได้ว่า “r.p.m.”  Speed of the centrifuge ความเร็วในการปั่นหรือหมุนของหัว rotor จะวัดเป็นหน่วย รอบต่อนาที (Revolutions per minute : RPM) ค่าแรงเหวี่ยงหนีศูนย์กลางที่เกิดจากการหมุนหัวปั่น ของ centrifuge ด้วยความเร็วดังกล่าวนี้จะเรียกว่า ค่าแรงหนีศูนย์กลางสัมพันธ์ (Relative centrifugal force: RCF) หรืออาจเรียกว่าแรงโน้มถ่วง (gravities : g) ก็ได้ ซึ่งสามารถเขียนความสัมพันธ์ของค่าดังกล่าวเป็นสูตรคานวณได้ดังนี้ RCF(g) = 1.118 × 10−5 × r × (rpm)2 โดยที่ 1.118 × 10−5 เป็นค่าคงที่วัดจากการคานวณค่า angular velocity r คือ ค่ารัศมีของหัวปั่นมีหน่วยเป็น เซนติเมตร ซึ่งจะวัดตั้งแต่จากแกนกลาง หัวปั่นไปจนถึงฐานรองก้นหลอดของ shield หรือ bucket RCF คือ แรงหนีจุดศูนย์กลางสัมพันธ์ มีหน่วยเป็นเท่าของค่า g RPM คือ อัตราความเร็วรอบ มีหน่วยเป็น รอบ/นาที  ตัวอย่างการคานวณ ***หากทราบค่า RCF หรือรัศมีของหัวปั่น ก็สามารถทราบค่า RPM ได้ ในทาง กลับกัน หากทราบค่า RPM ก็สามารถคานวณค่า RCF ได้*** ตัวอย่างที่ 1 : If a rotor with an average radius of 7 cm revolves at a speed of 20,000 rpm, How much RCF is created? วิธีทา 1. จากสูตร RCF (g) = 1.118 × 10−5 × r × (rpm)2 2. แทนค่าที่ทราบ RCF = 1.118 x 10-5 x 7 x (20,000)2 = …………g  ตัวอย่างการคานวณ ตัวอย่างที่ 2 : A fixed-angle rotor exhibits a minimum radius, rmin, at the top of the centrifuge tube of 3.5 cm, and a maximum radius, rmax, at the bottom of the tube of 7.0 cm. If the rotor is operated at a speed of 20,000 r.p.m., what is the relative centrifugal field (RCF) at the top and bottom of the centrifuge tube? วิธีทา 1. จากสูตร RCF (g) = 1.118 × 10−5 × r × (rpm)2 2. แทนค่าที่ทราบจากโจทย์ 2.1 Top of centrifuge tube: RCF = 1.118 x 10-5 x (20,000)2 x 3.5 g rmin = 15,680 g rav 2.2 Bottom of centrifuge tube: rmax RCF = 1.118 x 10-5 x (20,000)2 x 7.0 g = 31,360 g นอกจากการใช้สูตรคานวณ สามารถแปลง ค่า RCF  RPM ได้จาก nomograph Draw a straight line through known values in two columns : The desired figure can then be read where the straight line intersects the third column. รัศมีเครื่องปั่น RCF RPM http://www.druckerdiagnostics.com/g-force  โครงสร้างของ Centrifuge เครื่องปั่นแยกตะกอน ประกอบด้วยโครงสร้างหลัก 4 ส่วน ได้แก่ 1. มอเตอร์และอุปกรณ์ทดรอบ (Motor and Gear box) 2. หัวปั่น หรือ Rotor จะต่อกับส่วนแกนหมุนของมอเตอร์ หากเป็นเครื่องปั่นที่สามารถกาหนดอุณหภูมิได้จะมีส่วน air compressor อยู่ด้วย 3. ส่วนใส่สิ่งส่งปั่น หรือ Chamber หรือ Bucket 4. ส่วนที่ควบคุมการทางานของเครื่อง (control panel) เนื่องจากเครื่องปั่นเป็นเครื่องที่สร้างแรงหนีศูนย์กลาง ดังนั้นเพื่อความปลอดภัยของผู้ใช้ ตัวเครื่องมักจะมีการติดตั้ง ฝาปิด (lid) เพื่อป้องกันการกระเด็น-กระจายของสิ่งส่งตรวจหรือเศษหลอดที่แตก นอกจากนี้เครื่องปั่นสมัยใหม่มักมี เบรก เพื่อให้เครื่องหยุดการหมุนปั่นในกรณี ฉุกเฉิน หรือ tachometer สาหรับใช้ในการตรวจจับความเร็วว่าเหมาะสมหรือไม่ https://www.medicalexpo.com/prod/eppendorf-ag/product-68382-962699.html http://edusanjalbiochemist.blogspot.com/2012/11/principle-of-centrifugation.html  Centrifuge classification การแบ่งประเภทเครื่องปั่นเหวี่ยงตกตะกอนมีรูปแบบการจัดหมวดหมู่หลายวิธี โดยใช้คุณสมบัติของเครื่องปั่น เป็นตัวกาหนด ตัวอย่างเช่น  ขนาดของเครื่องว่าเป็นเครื่องขนาดเล็กตั้งโต๊ะ (benchtop) หรือเป็นเครื่อง ขนาดใหญ่ตั้งพื้น (floor model)  ตัวเครื่องสามารถกาหนดอุณหภูมิในการปั่นได้หรือไม่ (refrigeration)  ลักษณะของหัวปั่นเป็นแบบใด เช่น หัว fixed, hematocrit, swinging-bucket, หรือ angled  ความเร็วสูงสุดที่เครื่องสามารถปั่นได้ มีตั้งแต่ low speed, high speed, ultracentrifuge http://sydney.edu.au/medicine/bosch/facilities/molecular-biology/centrifugation/  Types of Centrifuges A. Microcentrifuges หรือ microfuges Centrifuges ชนิดนี้มักเป็นแบบตั้งโต๊ะ (bench-top) ส่วนใหญ่ ใช้ในการปั่นเก็บสิ่งตัวอย่างที่มีปริมาณน้อยเช่น เม็ดเลือด ซึ่งมี ปริมาตรสารอยู่ระหว่าง 0.5–1.5 cm3 (micro- เนื่องจาก ตัวอย่างจะบรรจุอยู่ในหลอด Eppendorf tubes ความเร็ว สูงสุดของเครื่องจะอยู่ที่ประมาณ 10,000 g จึงมักพบว่ามักใช้ใน การปั่นแยก/สารชีวโมเลกุลต่างๆ เช่น โปรตีน DNA RNA หรือ การทาให้สารเหล่านี้เข้มข้นขึ้น สาหรับการปั่นสกัดสารที่เสื่อมสลายง่ายมักใช้เครื่องปั่นที่มี ระบบทาความเย็นในตัวด้วย (refrigerated microfuges) http://gaiascience.co.id/inner_details.php?id=23 http://www.rosesci.com/Products/products.php?  Types of Centrifuges B. Large-capacity preparative centrifuges (ใช้ในงาน Routine ของ clinical laboratory) เครื่องปั่นชนิดนี้มีข้อดีคือ สามารถเปลี่ยนใช้หัวปั่นตามความเหมาะสมกับงานได้ ทาให้ สะดวก สามารถปั่นสิ่งส่งตรวจที่บรรจุในหลอดหรือภาชนะได้หลากหลายรูปแบบซึ่งอาจ เป็นหลอดเลือดหรือ ELISA plate ก็ได้ โดยทั่วไป สิ่งส่งตรวจมักมีปริมาตรอยู่ระหว่าง 5–250 cm3 มีความเร็วสูงสุดอยู่ที่ประมาณ 3000–7000 g ซึ่งเพียงพอต่อการแยกเซลล์ ออกจากเลือดครบหรือการแยกสารแบบหยาบ นอกจากนี้ เครื่องปั่นยังมีราคาไม่สูงมาก คงทน ดูแลรักษาง่าย จึงเหมาะสาหรับงาน routine งานปั่นต่อเนื่อง หรืองานที่มีตัวอย่างปริมาณมาก (high throughput assays) https://www.alibaba.com/product-detail/Plate-Centrifuge-2-x-96-well_60103096874.html http://www.thelabworldgroup.com/centrifuges/eppendorf-5810r-refrigerated-centrifuge-300357  Types of Centrifuges C. High Speed refrigerated centrifuges เครื่องปั่นประเภทนี้สามารถทาความเร็วได้สูงสุด 100,000 g จึงมักใช้ในการปั่นตะกอนโปรตีน, ตะกอนเศษเซลล์จาก tissue homogenization, เชื้อจุลชีพ, และ organelles ที่มีขนาดใหญ่ เช่น nuclei, mitochondria หรือ chloroplasts (อย่างไรก็ตามยังไม่เพียงพอสาหรับการแยก ribosomes หรือ smaller microsomal vesicle) D. Ultracentrifuges Ultracentrifugation มีประโยชน์มากในการศึกษารายละเอียด subcellular structures เนื่องจากสามารถปั่นแยก/สกัด organelles และสาร biomolecules ขนาดเล็ก บางเครื่องสามารถทาความเร็วได้สูงสุดถึง 600,000 g การที่เครื่องทาความเร็วมากๆ จะทาให้หัวปั่นเกิดความร้อนมาก ดังนั้นจึงต้องมีระบบหล่อเย็น นอกจากนี้เครื่องปั่น จะประกอบด้วยแผ่นเหล็กหนาและสกูรยึดติดกับพื้น เพื่อความปลอดภัยของผู้ใช้เครื่อง ในกรณีที่หัวปั่นเกิดความผิดพลาดหรือสั่นรุนแรง https://www.gibthai.com/product/product_detail/31134  ตารางเปรียบเทียบคุณสมบัติของเครื่องปั่นแต่ละประเภท Parameters Low speed High speed Ultracentrifuge 1. Speed range(rpm) 2000-10000 18000-30000 40000-100000 2. Refrigeration Some Yes Must 3. Vacuum system None Some Must 4. Application for pelleting Cells Yes Yes Yes Nuclei Yes Yes Yes Membranous Organelles Yes Yes Membrane - Some Yes Ribosome or Polysome - - Yes Macromolecules - - Yes  Types of Rotor ไม่ว่าจะเป็นเครื่องปั่นประเภทใด สิ่งสาคัญที่ทาให้เกิดแรง centrifugal forces ที่แตกต่าง กันก็คือ ส่วนหัวปั่น (Rotor) → ซึ่งเป็นส่วนสาหรับบรรจุ/แขวนภาชนะใส่ตัวอย่าง ส่วน รูปแบบของ rotor มีให้เลือกตามลักษณะการใช้งาน โดยทั่วไปแบ่ง rotor ออกเป็น 3 ชนิด คือ 1. Horizontal head หรือ Swinging bucket rotor มี holder หรือ bucket สาหรับใส่หลอดเลือด เมื่อเครื่องเริ่มปั่น แรงหมุนจะค่อยๆ ปรับ holder ให้อยู่ในแนวนอน สารจะเคลื่อนตัวลงสู่ก้นหลอดอย่างสม่าเสมอ ทาให้พบ ลักษณะการแยกของตะกอนแบบผิวตัดเรียบ มักใช้ในการแยกสารที่ต้องการแยกละเอียด เช่นการปั่นตกตะกอน RNA Bishop, M.L. & Fody, E.P. & Schoeff, L.E.. (2013). Clinical chemistry: Principles, techniques, and correlations: Seventh edition.  Types of rotor 2. Angle-head centrifuge หรือ Fixed angle rotor หลอดเลือดจะเอียงทามุมจากแกน 25-40 องศา เมื่อทาการปั่น สารจะตกตะกอนใน แนวราบกระทบกับผนังด้านข้างของหลอดเลือดแล้วเลื่อนไถลลงสู่ก้นหลอด ดังนั้น ลักษณะการแยกจึงพบว่าเอียงเป็น slant มักใช้ในการแยกสารหลายชนิด (ที่มีอัตราการตกตะกอนไม่เท่ากัน) จากสารผสม เช่น การแยก nuclei, mitochondria หรือ microsomes จากเซลล์ ***ข้อควรระวัง*** เมื่อนาหลอดออกมาวางใน rack หากมีการกระเทือนจะทาให้ ตะกอนส่วนบนหลุดฟุ้งกระจายออกมา https://www.djblabcare.co.uk/djb/product/2444/Centrifuges-75004220-Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_X1 Bishop, M.L. & Fody, E.P. & Schoeff, L.E.. (2013). Clinical chemistry: Principles, techniques, and correlations: Seventh edition.  Types of rotor 3. Vertical-tube rotor มักใช้ในงานแยกที่ต้องการความรวดเร็ว โดย rotor ประเภทนี้จะมีช่องใส่ตัวอย่างอยู่ใน แนวขนานกับแกนกลางของการหมุน ดังนั้นเมื่อเปรียบเทียบกับ swinging-bucket rotors จะพบว่ามีรัศมีการปั่นที่น้อยกว่า เวลาที่ใช้ในการปั่นตกตะกอนจึงลดลง และข้อเสียคือ ความละเอียดในการแยกชั้นสารจะต่ากว่าหัวปั่นแบบอื่นๆ http://www.directindustry.com/prod/grant-instruments/product-26122-981951.html https://www.labmerchant.com/product/Vertical-Tube-rotor-Beckman-/5515  Types of rotor axis of rotation Swinging-bucket At rest Spinning g g Fixed-angle  Centrifuge rotors Swinging bucket centrifuge Fixed angle centrifuge http://deninasimmons.com/blood-plasma-for-monitoring-wildlife/ https://www.alibaba.com/product-detail/TDL-60B-blood-centrifuge-with-10_60053541686.html http://www.thelabworldgroup.com/centrifuges/eppendorf-5804-benchtop-centrifuge-eppendorf5804521  Types of centrifugation rotors http://www.biologydiscussion.com/biochemistry/centrifugation/centrifuge-introduction-types-uses-and-other-details-with-diagram/12489  Care and maintenance of centrifuges ควรดูแลทาความสะอาดตัวเครื่องเป็นประจา ก่อน-หลังการใช้งาน หากพบหยดน้าหรือเลือดหรือ เศษหลอดแตกในตัวเครืองหรือ bucket ควรรีบทาความสะอาดและนาเศษหลอดออก (โดยใช้ forcep คีบออก) เพื่อป้องกันการกัดกร่อนของตัวเครื่องและการปนเปื้อนในการปั่น หากปั่นเย็นอาจพบว่ามีหยดน้าเกาะรอบหัวปั่นและห้องปั่น ให้พยายามซับน้าออกให้มากที่สุดพร้อมทั้ง เปิดฝาไว้ให้เครื่องแห้ง ควรเลือกใช้หัวปั่นให้เหมาะสมกับหลอดบรรจุสิ่งส่งตรวจ และต้องปิดฝาเครื่องทุกครั้งเพื่อความปลอดภัย ของผู้ใช้งานและป้องกันสิ่งส่งตรวจกระเด็นออกมา ฝาของหลอดภาชนะสิ่งส่งตรวจควรตรวจให้แน่ใจว่าปิดสนิทดี ไม่มีรอยร้าว หากหลอดภาชนะบรรจุสิ่งส่ง ตรวจเกิดแตกอยู่ภายในเครื่อง ผู้ทาความสะอาดจะต้องใส่อุปกรณ์ป้องกันให้หนาแน่น เนื่องจากสิ่งส่งตรวจที่ กระจายออกมาจะฟุ้งในอากาศ ไม่ควรปั่นสารละลายที่มีฤทธิ์กัดกร่อนเช่นสารละลายกรด-ด่าง หรือ aggressive detergents ***ไม่ควรเปิดฝาเครื่อง ในขณะที่เครื่องปั่นยังไม่หยุดหมุนสนิท***  Balancing the centrifuge load is critical **สาคัญมาก** ในการปั่นตกตะกอน จาเป็นต้องตั้งสมดุลของน้าหนัก/ปริมาตร ของแต่ละข้างตรงข้ามของหัวปั่นให้เท่ากัน แม้ในเครื่องปั่นสมัยใหม่จะมีระบบหยุด การปั่นอัตโนมัติหากตรวจพบว่าหลอดเลือดที่ปั่นไม่มีความสมดุล เครื่องปั่นจะสั่น, มีเสียงดังและอาจส่งผลให้แกนของ rotor เครื่องปั่นชารุด ควรมีบันทึก logbook การใช้เครื่อง เพื่อใช้ในการนัดหมายให้ช่างมาตรวจเช็คและซ่อมบารุง  Preparative Centrifugation : Differential centrifugation เมื่อกาหนดให้ความหนาแน่น/ความหนืดของของตัวทาละลายต่า และอนุภาคที่ ต้องการแยกมีความหนาแน่นมากกว่าตัวทาละลาย ดังนั้นปัจจัยที่ทาให้อัตราการ ตกตะกอนของสารมีความแตกต่างกันจะขึ้นอยู่กับขนาดและความหนาแน่นของสาร/ อนุภาคที่ไม่เท่ากันและแรงปั่น (g) เท่านั้น – ยิ่งสารที่มีขนาด/ความหนาแน่นมากก็จะเกิดการตกตะกอนเร็วขึ้นเท่านั้น – เทคนิคนี้มักใช้ในงาน routine แยก plasma/serum, แยก lipoprotein ชนิดต่าง ๆ และการแยกส่วนประกอบต่าง ๆ ของเซลล์ออกมาศึกษารายละเอียด  Preparative Centrifugation : Differential centrifugation ยกตัวอย่างเช่น ในการแยกส่วนประกอบของเซลล์ เมื่อเริ่มปั่นครั้งแรก สารที่มีความ หนาแน่น/มวลโมเลกุลมากเช่น cellular debris จะเกิดการตกตะกอนก่อน เมื่อเรานา ส่วนใส (supernatant fractions) ออกมาปั่นด้วยความเร็วที่มากขึ้น สารที่มีความ หนาแน่น/มวล มากลาดับต่อมาจะเกิดการตกตะกอน เมื่อเราทาการเก็บตะกอนแล้วปั่นส่วนใสไปเรื่อยๆ สารที่ได้จะมีความหนาแน่น/มวล ลดลงเรื่อย ๆ ตามลาดับ ข้อเสีย : Poor resolution and recovery http://stevegallik.org/cellbiologyolm_fractionation.html  Density gradient centrifugation สาหรับสาร/อนุภาคที่มีขนาดเท่ากัน แต่มีความหนาแน่นแตกต่างกัน → การ ปั่นตกแบบ Differential centrifugation จะสามารถแยกได้ไม่ค่อยดีเท่าไร ดังนั้นต้องใช้เทคนิค density gradients แทน หลักการคือ เมื่อสารผสม เช่น เลือดครบหรือสารละลายเซลล์ถูก layered บนชั้นของสารละลายที่มีคุณสมบัติไล่ตามความหนาแน่น (density gradient) เมื่อเริ่มปั่น → สาร/อนุภาคจะเคลื่อนที่ตกตะกอนไปอยู่ ณ บริเวณของ สารละลายที่มีความหนาแน่นเท่ากับความหนาแน่นของตนเอง  ตัวอย่าง density gradient solution Caesium chloride ซึ่งใช้ในการสกัดแยก DNA, plasmids, nucleoproteins และ viruses Sodium bromide และ sodium iodide ซึ่งใช้ในการสกัดแยกชนิดของ lipoproteins และ DNA/ RNA Ficoll-Hypaque gradient solution ซึ่งใช้ในการสกัดแยก PBMC จากเลือดครบ ข้อควรระวัง : สารที่แยกชั้นสาเร็จแล้วควรตั้งไว้ใน holder ที่มั่นคง เพราะหากมีการสั่นสะเทือนเกิดขึ้น ชั้นสารต่างๆจะทาให้เกิดการฟุ้งกระจาย จนไม่สามารถแยกตัวอย่างจากชั้นที่ต้องการได้ http://cbc.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture2/Lecture2.html https://dublinlisacoolsaet.wordpress.com/2013/05/03/pbmc-fasen/  ตัวอย่าง density gradient solution การแยก lipoprotein ด้วยวิธี Ultracentrifugation แยกตาม density เมื่อปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่องปั่นความเร็วสูง Lipoprotein ที่มีความหนาแน่นน้อย จะลอยขึ้นด้านบน lipoprotein ที่มี ความหนาแน่นสูงจะตกลงสู่ด้านล่าง CM: Chylomicron, VLDL: very low density lipoproteins, IDL: intermediate density lipoproteins, LDL: low density lipoproteins, HDL: High density lipoproteins Chait, Alan, et al. "Remnants of the triglyceride-rich lipoproteins, diabe tes, and cardiovascular disease." Diabetes 69.4 (2020): 508-516. How to use Bench Top centrifuge VDO