Extracción de Ácidos Nucleicos

Extracción de Ácidos Nucleicos (ADN y ARN)

• Objetivo: Separar ácidos nucleicos (ADN y ARN) de otros componentes celulares o ambientales.
• Adaptar protocolos: Los protocolos de extracción deben ajustarse al tipo de muestra para obtener buena calidad y cantidad del ácido nucleico.

Pasos Básicos de Extracción de ADN

• 1. Ruptura de células:

  • Detergentes: (SDS, NP40, sarkosil) para células en cultivo, tejidos, parásitos. Rompen la membrana celular.
  • Enzimas: (lisozima) para ADN bacteriano (total o plasmídico). Rompen las uniones de la pared celular bacteriana.
  • Desnaturalizantes: (cloruro de guanidina) para diferentes tipos celulares y tejidos.

• 2. Eliminación de proteínas:

  • Enzimas proteolíticas: (proteinasa K) digiere proteínas.
  • EDTA: Inhibe las DNAasas.
  • CTAB (bromuro de hexadecil trimetil amonio): Para muestras ricas en glicoproteínas (micobacterias, tripanosomas), ayuda a eliminar glicoproteínas.

• 3. Eliminación de ARN:

  • RNAsas: (ribonucleasa A) digieren el ARN. A veces en la etapa final de la extracción de ADN.

• 4. Desproteinización:

  • Solventes orgánicos: (fenol, cloroformo) desnaturalizan proteínas.
    • Fenol: Bidestilado, equilibrado, protegido de la oxidación con 8-hidroxiquinolina.
    • Cloroformo: Mezclado con alcohol isoamílico (24:1) para evitar espuma y facilitar separación de fases.
  • Relación solvente/muestra: 1:1.
  • Separación de fases: Proteínas en la interfase, ADN en la fase acuosa.
  • Extracciones sucesivas: Generalmente se realizan extracciones con fenol, fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y finalmente cloroformo-alcohol isoamílico para remover trazas de fenol.

• 5. Concentración del ADN:

  • Precipitación con etanol: En presencia de cationes monovalentes (0.1-0.5 M). (acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio, cloruro de litio)
  • Eliminación de residuos: Elimina fenol y cloroformo.
  • Agregado/Precipitación del ADN: Cationes producen cambios estructurales que provocan la agregación y precipitación del ADN.

Extracción de ARN

• Precauciones:
  • Contaminación por RNAsas: Trabajar en ambientes libres de RNAsas, usando guantes y esterilizando materiales.
  • Velocidad: Trabajar lo más rápido posible.
  • Muestras: Usar muestras frescas, si no, congelar en nitrógeno líquido y almacenar a -70 °C. Homogeneizar en tampón de lisis y almacenar a -70 °C.
  • Almacenamiento: ARN a -70 °C para evitar degradación. RNA later (amibion #7020) para almacenar a 4°C o 20°C con tiempos prolongados.

Condiciones para obtener buenos rendimientos y calidad de extracciones

• Utilizar guantes.
• Usar material estéril y libre de RNAsas.
• Tratar mesones y cabinas con etanol al 70% / Agua oxigenada 10V / DEPC 0.1%
• Usar muestras recién recolectadas, si no, almacenar adecuadamente.

Este cuestionario se centra en los métodos de extracción de ácidos nucleicos, incluyendo ADN y ARN. Se discutirán los diferentes protocolos y pasos necesarios para obtener una buena calidad y cantidad de los ácidos nucleicos de las muestras. Es fundamental entender la importancia de los reactivos y condiciones en el proceso de extracción.