T12 Tec generales lab

Introducción y contextualización práctica

• El microscopio ha sido clave en ciencias como medicina y biología para entender la morfología y función de células y tejidos.
• Los avances tecnológicos han impulsado la evolución del microscopio, adaptándolo a diversas aplicaciones en laboratorios modernos.

Aparición del microscopio e importancia actual

• La palabra "microscopio" proviene del griego "micros" (pequeño) y "skopein" (examinar).
• La Real Academia Española define microscopio como un instrumento óptico para observar objetos pequeños no visibles a simple vista.
• La óptica, que estudia el comportamiento de la luz, ha permitido conocer y observar la formación de imágenes de muestras a través de la microscopía.
• Hans y Zaccharias Janssen crearon un prototipo simple del microscopio al fabricar anteojos a principios del siglo XVII.
• Galileo Galilei también contribuyó a su desarrollo.
• Robert Hooke fue el primero en usar el microscopio para estudios científicos, observando la estructura interna del corcho en 1665 y acuñando el término "célula".
• Antoine Van Leeuwenhoek fabricó el microscopio simple a finales del siglo XVII.
• Gracias a él, se observaron protozoos, bacterias, glóbulos rojos y espermatozoides.

Tipos de microscopios

• Los microscopios se clasifican en ópticos y no ópticos.
• Los microscopios ópticos utilizan un sistema de lentes para observar muestras mediante la refracción de la luz.
• Los microscopios no ópticos se estudian en otro módulo.
• Entre los microscopios ópticos, se diferencian los simples, con una sola lente (como la lupa), y los compuestos, con sistemas de lentes (objetivo y ocular) que permiten aumentos de hasta 1000x.
• Los microscopios no ópticos incluyen los electrónicos (que emiten luz a través de electrones), protónicos (que usan protones), de excitación (por electrones o fotones) e iónicos (por emisión de iones).

El microscopio óptico

• El microscopio óptico, también llamado de luz o de campo claro, consta de un sistema mecánico, uno óptico y uno de iluminación, además de otros accesorios.
• El sistema mecánico incluye la base, columna, sistema de enfoque, platina, revólver y tubo, variando en dimensiones y forma según el fabricante.
• El sistema óptico se compone de los objetivos (insertados en el revólver) para observar las muestras y del ocular.
• El sistema de iluminación incluye la fuente de luz, el condensador y el diafragma.
• Otros accesorios como cámaras, vídeos y ordenadores facilitan el trabajo, permitiendo medir, cuantificar, fotografiar, procesar vídeos y dibujar muestras.

Parte óptica

• La parte óptica del microscopio incluye objetivos y oculares, junto con el sistema de iluminación (condensador, diafragma y fuente de luz).
• Los objetivos recogen la luz de la muestra para proyectar una imagen, con aumentos de 4x, 10x, 40x y 100x.
• Existen objetivos secos y de inmersión, estos últimos necesitan aceite para mayor resolución, especialmente a 100x aumentos.
• Los oculares, formados por una o dos lentes, permiten observar las muestras y aumentan adicionalmente la imagen proyectada por los objetivos.
• El aumento total se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular.
• Las lentes oculares aumentan la imagen real del objetivo.
• Las lentes colectoras aplanan y aclaran el campo óptico, pero a mayor aumento, menor campo de visión.

Parte mecánica

• La parte mecánica consta de base, columna, platina, sistema de enfoque, pinzas, tubo o cabezal y revólver.
• La base da estabilidad y sujeción a la columna, alojando el sistema de iluminación.
• La columna sujeta el tubo del microscopio.
• La platina es el soporte metálico donde se colocan las muestras, con una apertura central para el haz de luz del condensador.
• El sistema de enfoque, con tornillos macrométrico y micrométrico, ajusta la platina.
• El tornillo macrométrico realiza un primer enfoque ajustando verticalmente la platina.
• El tornillo micrométrico permite un enfoque más fino, usado con objetivos de mayor aumento.
• Las pinzas sujetan la muestra, posicionada en un portaobjetos cubierto con un cubreobjetos.
• El revólver es un dispositivo giratorio donde se insertan los diferentes objetivos.

Técnicas microscópicas. El campo claro

• El microscopio de campo claro es el más simple, con un sistema de luz que atraviesa y refleja la luz en las muestras sin alterarlas.
• La luz del condensador es recogida por los objetivos, formando una imagen virtual de la muestra.
• Las muestras suelen teñirse con tinciones como azul de metileno o permetrina, o pigmentos naturales.
• Se utiliza para cortes histológicos finos, muestras sanguíneas, orina, heces y líquidos biológicos.
• No es útil para muestras sin tinción o componentes subcelulares, y tiene un aumento máximo menor que otros microscopios.

El campo oscuro

• La resolución es la capacidad del microscopio de mantener separados dos puntos muy cercanos.
• El límite de resolución o poder de resolución se ve afectado por la longitud de onda y la apertura numérica.
• Se usa aceite de inmersión en objetivos de 100 aumentos para aumentar la apertura numérica y la resolución.
• El microscopio de campo oscuro permite estudiar células vivas o muestras no teñidas, que no se verían bien con el microscopio de campo claro.
• Se utiliza para muestras biológicas transparentes sin pigmentación, como microorganismos acuáticos, células en cultivo o procesos mitóticos.
• Destaca su sistema de iluminación Rheinberg, que usa filtros de colores para la muestra y el fondo oscuro, combinando la iluminación del campo claro con la del campo oscuro.

El contraste de fases

• Tras estudiar muestras con el microscopio de campo oscuro, se observó que la luz producía condiciones de contraste.
• El microscopio de contraste de fases permite estudiar muestras transparentes, aumentando el contraste entre zonas claras y oscuras.
• Frits Zernike inventó este microscopio y ganó el Premio Nobel de Física en 1953.
• El microscopio de contraste de fases es similar al de campo oscuro, pero el haz de luz proyectado es más estrecho y reduce la intensidad de luz.
• Para obtener un microscopio de contraste de fases, se cambian el condensador y los objetivos por unos especializados.
• Se utiliza para observar células y tejidos vivos, procesos celulares, parásitos y el efecto de medicamentos en células, además de estudios de minerales y materiales.

Microscopía la fluorescencia

• Permite observar muestras pequeñas gracias a la luz que emiten.
• La fluorescencia es la capacidad de algunos elementos de emitur luz visible, es decir, captar luz de una longitud de onda y projectar una luz de mayor longitud.
• Estos elementos se denominan fluoróforos o fluorocromos
• Cada uno tiene un espectro de absorción y emisión especifico
• Los mas utilizador son rodamina(luz roja), GFP(luz verde) i DAPI(luz azul)
• Se necesita una fuente de luz sea intensa, filtros que inhiben longitudes que no son deseadas
• Es muy usado sus aplicaciones en el area de medicina y biologia, sobretodo para marcaje células, tejidos o estudios inmunologicos

Contraste de polarización y contraste interferencial de Nomarski

• El microscopio de luz polarizada, permite el constraste de polarizacin

• Útil en el estudio de muestras birrefrigentes (capacidad de desdoblar el rayo i producir una dobre refraccion del haz de luz

• Compuesto por filtros polarizados: entre condensador, muestra, y ocular

• Utilzado en cristalografia y en el estudio de sustancias cristalinas como el citoesqueleto o las fibras de colágeno

• El microscopio de Contraste interferencial de Nomarski (DIC) para tratamientos de fertilización in-vitro, células vivas y muestras que no permiten el uso de la microscopía de contraste

• Este último se compone de rayos de polarización, uno con luz sobre la muestra y el otro lateral, creando imagenes similares al contraste de fases

Microscopía confocal

• Microscopio confocal inventado por Marvin Minsky, similar al de ffuorescencia que permite obtener imagenes en 3D
• Se necesita un sistema de luz compuesto de rayos laser multifrecuencia y un filtro de interferencia
• Mediante el escaneo con un laser crea imagenes 2D un uso de programas, que crean imagenes en 3D
• En biologia celudar y en biomedicina para el estudio de procesos celulares como las reacciones de oxidación o fagacitosis

Posibles problemas i soluciones durante la observación microscópica.

• Si no se puede observar correctamente, las imágenes salen borrosas, dispersas, o con falta de resolución
• Es imprescindible tener un buen manejo de cada funcion del microscopio
• Algunos de estos problemas son

Oscuridad en la periferia

• Causa: Mal unión de objetivos
• Solución: Revisar los objetivos y enroscarlos/desenroscarlos bien

Imagen borrosa y dispersa

• Causa: el uso del aceite de inmersión o la existencia de burbujas
• Solución: A usar en el 100X de aumento, y quitar los portaobjetos y cubreobjetos bien limpios

Campo de visión sucio

• Causa: Condensador bajo, o su apertura reducida
• Solución: Ajustar altura del condensador, la apertura del diafragma o limpiar la lente

Brillos o iluminación inadecuada

• Causa: Obetivo, o el sistema de iluminación no centrado
• Solución: limpiar lente del condensador y revisar que no haya ningún agente impidiendo la visión.

Caso practico mediciones "micromediciones"

• Los oculares estan formados por lentes, amplificando la imagen
• El aumento total se obtiene multiplicando el aumento total por el del ocular
• Si el objetivo es de 40x, las muestras en algun momento tienen que estar calibradas para que den con marcas la medida real "regla de medición"
• Para realizar una calibración entre el ocular 10x y un objetivo de 40 x se requiere una alineación de la récula objetiva como muestra en la imagen
• El valor real del longitud de cada división se obtiene VRsub= Lp dividido por subdivision

Applicationes de la microscopia optica

• Principalmente son utilizadas en el ambito de la biologia i la medicina
• Excepto el microscopio de constraste de fases y el contraste de polarizacion que se usan en el proceso de la mineralogia