Hibridación Test Mixto

El concepto de hibridación

• La hibridación une dos moléculas de ácidos nucleicos monocatenarias mediante la complementariedad de sus bases nitrogenadas, formando una molécula híbrida bicatenaria.
• Es un proceso artificial para construir ácidos nucleicos bicatenarios, donde dos cadenas complementarias de diferentes moléculas (ADN, ARN o ambas) se unen.
• En biología molecular, se usa para detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos con fragmentos complementarios (sondas) marcadas para visualización.
• La hibridación molecular es crucial para estudiar el ADN, identificar genes y analizar su actividad, sirviendo como base para PCR, arrays y otras aplicaciones.
• Se basa en la unión por complementariedad de bases de secuencias nucleotídicas, utilizada para detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos (dianas) con sondas.

Secuencia diana y sonda

• La secuencia diana es la secuencia específica de bases nitrogenadas a detectar en la muestra.
• La sonda es una cadena de nucleótidos con una secuencia de bases nitrogenadas complementaria a la secuencia diana.
• Las técnicas de hibridación varían según el tipo de ácido nucleico a detectar, el tipo de sonda, el marcaje de la sonda y el medio o soporte utilizado.

Bases teóricas de la hibridación

• El proceso de hibridación se basa en la desnaturalización y renaturalización de moléculas bicatenarias de ADN.

Desnaturalización

• Es la separación de las dos cadenas de una molécula bicatenaria al romper los puentes de hidrógeno entre bases nitrogenadas complementarias.
• Puede ocurrir por técnicas físicas y químicas, donde la cadena de ADN bacteriana pierde su forma helicoidal tridimensional.
• Las hebras segregadas pueden renaturalizarse por la complementariedad de sus bases.
• El aumento de temperatura provoca la desnaturalización y renaturalización del ADN diana y de las sondas, lo cual se representa en la curva de fusión del ADN.
• La medición de la absorbancia a 260nm de una solución de ADN bicatenario en función de la temperatura genera una curva sigmoide, o curva de fusión.

Curva de fusión del ADN

• La absorbancia a 260nm (A260) permanece constante a temperaturas por encima de las fisiológicas, indicando que la molécula está en forma de doble hebra.
• La A260 aumenta en un rango estrecho de temperaturas (6-8 °C) cuando las uniones entre las bases se rompen en varios segmentos de la molécula.
• La A260 máxima es aproximadamente un 37% mayor que el valor inicial, indicando que las dos hebras están completamente separadas.

Químicos para la hibridación

• Los cambios de pH debilitan o fracturan la unión de bases si se alejan del estado neutro, por lo que se usan condiciones alcalinas en la desnaturalización.
• Los agentes químicos compiten con las bases en la creación de puentes de H, permitiendo la segregación de las cadenas.
• La reducción de la concentración de sales disminuye la estabilidad de la molécula de ADN o sonda, bajando la temperatura necesaria para la desnaturalización.
• Los agentes químicos con grupos amino y carbonilo compiten en la creación de H, facilitando la segregación de cadenas y aportando especificidad a la reacción durante la renaturalización.

Temperatura de fusión

• La temperatura de fusión (Tm) es cuando el 50% de los puentes de hidrógeno están fracturados.
• Un aumento de 10°C separa completamente las cadenas.
• Si la temperatura baja bruscamente, las cadenas no pueden volver a unirse, pero si baja gradualmente, pueden unirse e hibridar.

Renaturalización

• Es el proceso por el cual las cadenas separadas de una molécula de ADN se reasocian al bajar lentamente la temperatura, formando la doble hélice original.
• Se mide por la disminución de la absorbancia a 260 nm.
• A diferencia de la desnaturalización, la concentración influye en la velocidad de renaturalización, mientras que la composición de las bases no lo hace.

Fases de reasociación

• Fase de nucleación: fase lenta donde secuencias cortas de bases complementarias se aparean por formación de puentes de hidrógeno.
• Fase de "cierre en cremallera": fase rápida en la que se cierran las secuencias, formando la doble hélice.

Hibridación (fases)

• Se requiere una muestra con fragmentos de ADN bicatenarios diana, una sonda marcada, medios de reacción y un soporte.
• Desnaturalizar ADN diana en medios adecuados.
• Desnaturalizar la sonda si es de doble cadena.
• Mezclar ADN diana y sonda sobre un soporte.
• Permitir la hibridación de los fragmentos mezclados en condiciones de temperatura adecuadas.
• Lavar para eliminar restos de sondas marcadas y ADN diana que han creado homodúplex.
• Detectar el marcaje y estudiar la región diana unida a la sonda marcada.

Factores que influyen en la hibridación

• La fuerza iónica de la solución, donde las moléculas de ácidos nucleicos tienen una carga eléctrica neta negativa.
• Los cationes monovalentes neutralizan la carga negativa, estabilizando la doble hélice y disminuyendo la repulsión electrostática.
• La concentración de la sonda debe ser mayor que la de ADN diana para evitar uniones inespecíficas.
• Se usan agentes desnaturalizantes como el dimetilsulfóxido y la formamida para desestabilizar los puentes de hidrógeno.
• El porcentaje de bases no complementarias puede formar híbridos imperfectos con menos puentes de hidrógeno.

Composición de las bases

• Cuanto mayor sea la estabilidad de G-C, más estabilidad tendrán los puentes de hidrógeno, requiriendo una mayor temperatura para la desnaturalización.
• En los medios de reacción y lavado, la disminución de la concentración de sales desestabiliza las uniones, afectando las fases del ensayo
• En la renaturalización se emplean concentraciones bajas para desestabilizar el ADN diana y disminuir la Tm.
• La hibridación usa concentraciones elevadas para evitar la repulsión electrostática y facilitar el acercamiento.
• Los lavados se realizan con concentraciones bajas para desestabilizar los híbridos no homólogos.
• La formamida disminuye la Tm, y una concentración más elevada es más astringente.

Otros factores en la hibridación

• El pH es alcalino en la desnaturalización y neutro en la hibridación.
• Polímeros inertes aceleran la hibridación con sondas largas.
• La concentración de ADN/ARN y el tiempo influyen: más ADN reduce el tiempo de hibridación y más tiempo aumenta la reasociación.
• La velocidad de reasociación (Cot) correlaciona la concentración inicial de ADN con el tiempo de hibridación.
• Las sondas disueltas en buffer incorporan fragmentos repetitivos para evitar interferencias.
• La incubación (37-42°C durante 12 horas) requiere una concentración alta de sales.
• En lavados, se aumenta la temperatura y se emplean adyuvantes químicos, pero la Tm en los lavados nunca debe estar por debajo de los 45°C.

Astringencia

• Es el proceso de disminución de uniones al azar aumentando la especificidad de la reacción
• Esto se logra con alta temperatura, baja fuerza iónica y presencia de agentes químicos.
• Si se quiere aumentar la sensibilidad, deben disminuirse las condiciones de astringencia.

Tipos de sondas

• Las sondas pueden ser bicatenarias o monocatenarias, variando en tamaño desde oligonucleótidos a grandes moléculas.
• La elección depende de la especificidad y sensibilidad deseadas, el tipo de muestra, la técnica y el marcaje.
• La especificidad discrimina la secuencia diana.
• La sensibilidad detecta las cantidades mínimas, relacionada con el número de moléculas de marcaje.
• No debe contener secuencias complementarias a otras regiones del genoma
• Los tipos de sondas son importantes para valorar los tipos de marcaje, la largura y el tipo de secuencia que se quiere analizar y el método de preparación de la técnica.

Sondas de ADN

• Son las más utilizadas por su facilidad de obtención, versatilidad en tamaño y métodos de marcaje
• Sus cinéticas de desnaturalización y renaturalización son más estudiadas.
• Pueden clasificarse según el proceso de obtención.

Sondas de síntesis química

• Se obtienen mediante condensación química secuencial, son monocatenarias y de tamaño reducido.
• Requieren desnaturalización por calor y permiten una mejor penetración en el tejido.
• Tienen desventajas como baja sensibilidad y facilidad para hibridar inespecíficamente.

Sondas de ADN recombinante

• Se obtienen por clonación y amplificación por cultivo.
• Son bicatenarias, necesitan de su desnaturalización, contienen intrones y exones, son grandes en volumen, permiten un gran número de moléculas marcadoras y tienen una alta sensibilidad.
• No suelen hibridar inespecíficamente.

Sondas de ADN por PCR

• Amplifican el fragmento de interés mediante la reacción en cadena de la polimerasa
• Son bicatenarias y de volumen intermedio.

Sondas de ARN

• Conocidas como ribosondas, se utilizan menos que las de ADN, se obtienen a partir de ADN bicatenario y tienen un volumen mediano.
• Se consiguen rompiendo el ADN bicatenario en diversos segmentos mediante enzimas de restricción y se colocan la ligasa de ADNr en el plásmido Psp64, lo que genera promotor SP6.
• El ADNr se transcribe a ARN con ARN polimerasa SP6.
• Son eficaces al interactuar con la secuencia diana y son menos propensas a formar homodúplex sonda.

Desventajas de las sondas ARN

• Técnicas complicadas para conseguirlas y la labilidad ante la contaminación de RNAsa, por lo que las sondas convencionales presentan un marcaje más complicado y una hibridación con la secuencia diana compleja.

El marcaje de las sondas

• Se marcan para poder detectar el híbrido formado con la secuencia diana.
• Los marcadores se clasifican según permitan o no la detección directa del híbrido, marcadores para detección directa (isótopos radiactivos y fluorocromos) y marcadores para revelado indirecto (haptenos: dogoxigenina y biotina).

Marcadores radioactivos

• El 32P es el más empleado, con alta actividad específica y partículas β de elevada energía.
• Las sondas tienen gran sensibilidad y rendimiento, aunque su vida es corta, de 14,3 días.
• Otros marcadores son 35S, 3H, 125l, y 14C con menor actividad específica pero mayor resolución y periodo de desintegración.
• Para detectar la hibridación, la autorradiografía plasma una imagen que indica la presencia de radiactividad en la película fotográfica.

Marcadores no radiactivos

• Se desarrollaron para evitar los problemas de los isótopos radioactivos, pueden ser marcaje directo o indirecto

• Los marcadores directos son:

  • Fluorocromos (fluoresceína o rodamina) emiten luz que se puede mesurar por fluorimetría.
    • Enzimas (peroxidasa o fosfatasa alcalina) se les incorpora un sustrato específico que se convierte en las enzimas, medido por espectrofotometría o quimioluminiscencia.

• Los grupos indicadores del marcaje indirecto son:

  • Biotina se detecta por unión de las proteínas avidina o estreptavidina marcadas tras la hibridación
  • Digoxigenina (esteroide) se detecta con un AC antidigoxigenina marcado
  • Las proteínas adivia o estreptadivina/抗-digoxigenina/antibiotina marcadas se usan para detectar mediante fluorocromos o enzimas.

Métodos de Marcaje: Marcaje directo en los nucleótidos de la sonda

• Las moléculas detectables se agregan gracias a una síntesis enzimática donde el ADN funciona como polimerasa.
• Nick Translation:
  • Se sustituye un 30-60% de los nucleótidos por nucleótidos marcados
  • Proceso en el que se consigue una sonda de ADN bacteriana marcada de forma uniforme y de alta sensibilidad
  • Se usa el marcaje para sondas de ADN grandes y de doble cadena y conseguidas mediante clonaje.
  • técnica rápida, fácil y barata

Random primer

• Requiere una ADN polimerasa que replica el ADN con cebadores de oligonucleótidos sintéticos de todas las secuencias posibles
• Marcaje uniforme y alta sensibilidad y se aplica a sondas de menor tamaño
• Se puede emplear con sondas conseguidas mediante clonaje o PCR y ha de desnaturalizarse para la hibridación con el oligonucleótido

Marcaje directo terminal

• Se alteran enzimáticamente los extremos de sonda de ADN o ARN al añadirle nucleótidos marcados
• Método talling:
  • Se emplea para el marcaje de las sondas de oligonucleótidos sintéticos y han de incluirse un número reducido de nucleótidos

Polinucleótido quinasa

• Intercambia el fosfato (P) en 5' terminal de la cadena de oligonucleótidos y la poli nucleótido se usa en sondas ADN o ARN
• Método fill-in end-labeling:
  • Enzima restricción lleva la función sobre los extremos de una sonda de ADN de doble cadena donde extremos escalonados que funcionan como molde para la ADN polimerasa I

Marcaje indirecto

• Sonda incorpora un grupo indicador no detectable, que se detecta en una segunda etapa por una molécula marcada

Fases de la hibridación

• La técnica de hibridación se divide en cuatro fases genéricas:
  • Prehibridación: Se prepara la muestra y el soporte.
  • Tm del híbrido:
    • La Tm es comprendida entre Tm -32°C y Tm -25°C
    • Se realiza en condiciones de alta concentración de cationes monovalentes y baja concentración de formamida

Lavado de poshibridación

• Se mantienen los híbridos sonda/secuencia diana y se eliminan los híbridos imperfectos
• La especificidad de la técnica dependerá muy importante de esta técnica
• Se detecta la unión de los híbridos específicos gracias al marcaje de la sonda La detección dependerá del tipo de marcador

Técnicas de hibridación: Hibridación en soporte sólido

• Se caracteriza por la inmovilización, sobre un soporte sólido, de una de las moléculas implicadas, la secuencia diana o la sonda
• Permite trabajar con diversas muestras al mismo tiempo
• La hibridación Dot-blot y Slot-blot:
  • Detectar secuencias de ácidos nucleicos , ADN o ARN, en una mezcla completa
  • Pasos de aplicación
    • Se humedece la membrana y se elimina el excceso
    • Se coloca un sistema de vacío para fijar la membrana

Pre-hibridación y Hibridación

• La Pre-hibridación impide inespecíficas de la sonda asegurando la unión de la secuencia diana
• Con sondas de ADN bicatena se calientan a 95-100°C para naturalizarlo para posteriormente se añaden a la solución de Pre-hibridación
• En esta fase se procede al Lavado de poshibridación
  • La fase contiene
    • baja concentración en sales
    • poca formamida
    • pH alcalino (<7)
• Tras ellos se pasa a la detección del híbrido - Marcaje radioactivo revelado mediante exposición autoradiográfica y Marcado con haptenos revelado mediante método cromogénico -Inmunohistoquímica
• Es posible volver a rehibridar si usamos marcaje radioactivo despejando la primera sonda con ayuda de una solución de baja fuerza iónica

Southern blot y Northern Blot

• El Southern blot fue desarrollado por E.M. Southern para la detección del ADN y para ello se debe digerir con una enzima de restricción, se separan por tamaños con una electroforesis en un gel
  • Se tiñe con bromuro de etidio y se desnaturalizan con un ácido para poder permitir la transferencia a un filtro de nitrocelulosa - Con el filtro se incuba en la sonda radiactivamente marcada que híbrida el ADN La sonda se visualiza con una placa de rayos X , se pasa hacer también con fluorocromos y la técnica es esencialmente igual en el caso de ARN

Microarrays de ADN

• Analizan el nivel de expresión de miles (o todos) los genes de una muestra
  • Se lanzarán el ARN a la muestra con previo transformado en cDNA, donde mayor expresión
  • La expresión por medio de luminosidad se detecta con un lector, para así fotografiar la experiencia

Aplicaciones en Patologías moleculares

• Detección de caminos/vías estimuladas en el metabolismo celular neoplasis
• Señalización por marcadores tumorales útiles en el diagnóstico y clasificación de la neoplasia

Hibridación en soporte líquido

• El híbrido a de estar en solución, más comunes en pocillos en placas microtiters posteriormente fijadas a la pared y se hace su detención
• Técnica de captura de híbrido - Hibridación en la formación de ARN/ADN capturada por anticuerpos
  • Si secuencia es ADN: sonda ---->> ARN, viceversa Se usas anticuerpos en las paredes de placas con los Heteroduplex para la : Desnaturalización - Hibridación y Captura

Técnica de ADN Ramificado

• Tecnología dirigida a aumentar la sensibilidad de las técnicas de captura de híbrido aumentando la cuantificación Técnica: sistema de amplificación de señal basada en la unión de la secuencia diana a un macrocomplejo de ADN uniéndose a virus de cargas

Hibridación in situ y FISH

• Se basa en muestras citogenéticas y tisulares, en portaobjetos
• Marcaje en cromosomas a de ser con ondas fluorescentes para estudiar e identificar, diagnosticando alteraciones de la expresión genética En los grupos se utiliza fluorescencia FITC y de Rodamina que comercialmente se hallan unidos, se clasifican acorde la función
  • Sondas centrométricas :marcan en el centrómetro y está diseñado apra zonas repetitivas.
  • Sondas teloméricas: zonas subteloméricas en cromosomas
  • Sondas de painting: Pintan el cromosoma por sumatoria de sondas
• Procesos a proseguir en la hibridación

Extensiones en hibridación

• Dos tipos: Histológicas- Citogenéticas con portaobjetos de cristal
  • No usarse ácido acético ya que los degradan Desnaturalización del ADN: Con ayuda de Soluciones buffer bajas y formamida la muestra requiere ser desparafinados en xilol Deshidratación proteica en frío: Introduciéndose al coplic , proceso que mantiene e ADN Las muestras Se cubres con cubreobjetos con pegamento , la disolución podría incorporar ADNcof Incubación en estufa a 37 grados y a oscuridad: se introduce coplin y luego solución de sales concentradas
• Se incluye contratinción fluorescente a lo núcleos ya que este no fue partícipe de la hibridación a este paso Hay 2 Tipos tinciones :
  DAPI 4,6-diamino que tiende de azul por la adenina y IP : Que añade rojo y sin afinidad
• En cuanto Al ANÁLISIS: El Microscopio ha se ser en un lugar oscuro y el daño a la luz la deterioran por eso el análisis Se realiza EN interfaces y Metafases

Aplicaciones

• El método FISH facilita la confirmación de alteraciones de cariotipo y de análisis de las zonas
• Permite aplicaciones clínicas el de diagnóstico genético: Prenetal: Analiza Anomalías FETALES para detectar malformaciones Posnatal: Analiza anomalías de anomalías en el desarrollo y estudio de expresión - oncogenes/supresores Preimplantacional: descarte de alteración en la muestra
• La hibridación permite efecto coloreado visible - En la hibridación in situ cromogénica se detecta secuencia de virus/tumores

Desparafinado y rehidratación

• Se basa en inmersión con cubetas de solventes para eliminar la parafina, luego diluir
• En cuanto la DIGESTION: El formol forma enlaces, se impide unir proteínas Y marcadores
• En el proceso hay Prehibridación - Se bloquea las uniones
• El ADN se pone sobre la paca calefactora
• Se usa ARN para detectar oligocleuótidos o ampliarla se hace por el laboratorio se requiere Acomodar las disoluciones.