Echtzeit-PCR und Nachweismethoden

Echtzeit-PCR (qPCR)

• Definition: Eine Modifikation der klassischen PCR, die die Quantifizierung eines PCR-Produkts durch fluoreszierende Farbstoffe und Sonden ermöglicht. Kombination aus DNA-Amplifikation und PCR-Nachweis. Der Fortschritt der PCR wird während des PCR-Zyklus gemessen.

Nachweismethoden

• Interkalierende Farbstoffe: Farbstoffe lagern sich in die DNA-Doppelhelix ein und ermöglichen den Nachweis durch Fluoreszenz. Beispiele sind SYBR Green.

• TaqMan-Sonden: Eine weitere Methode zur Detektion.

• Molecular Beacons (Weiterentwicklung): Eine Weiterentwicklung von Detektionsmethoden

• Hybridisationsproben: Ein weiterer Nachweismechanismus

Multiplex-PCR

• Definition: Mehrere PCR-Reaktionen in einem gemeinsamen Ansatz. Mehrere Amplifikationen auf einem DNA-Template.

• Voraussetzungen: Passende Primer sind entscheidend. Wird häufig mit verschiedenen fluoreszierenden Farben durchgeführt.

Real-time qPCR

• Synonyme: Quantitative Echtzeit-PCR, qPCR, Echtzeit-PCR

RT-PCR (Reverse Transkriptase-PCR)

• Prinzip: Amplifikation von RNA mittels PCR. Setzt die Reverse Transkriptase voraus.

• Schritt 1: RNA wird in DNA umgeschrieben (cDNA).

• Enzym: RNA-abhängige DNA-Polymerase. Reverse Transkriptase (oft modifiziert aus Retroviren wie MMLV). Manche DNA-Polymerasen besitzen auch RT-Aktivität.

• Schritt 2: cDNA → PCR-Amplifikation mittels Thermocycler.

• Zwei-stufiger Ablauf: cDNA-Synthese und qPCR in einem Röhrchen möglich. Eine-Schritt-Methode ermöglicht mehrere PCRs aus einer RNA-Probe ohne Multiplexing.

• Wichtig: RNA-Probe sollte in getrennten Röhrchen sein. Hoher Durchsatz und Automatisierung sind möglich.