Diagnostica Microbiologica: Campioni

Diagnostica Microbiologica

• Un corretto prelievo, è la prima fase della diagnosi
• La selezione corretta del campione da analizzare, è in base al sospetto clinico
• Esempi di campiono comprendono tampone, urine, feci, liquor, espettorato, broncoaspirato, lavaggio broncoalveolare, essudati, drenaggi, liquidi biologici e biopsie
• APPROPRIATEZZA diagnostica e ACCURATEZZA della diagnosi eziologica dipendono da corretta raccolta, conservazione e trasporto entro 2 ore alla giusta temperatura

Raccolta e trasporto dei campioni

• Ottenere l'informazione ed il consenso del paziente
• La raccolta deve avvenire in asepsi per evitare alterazioni del rapporto tra microbiota e patogeni
• Prelievo diretto: avviene in siti sterili mediante tecniche invasive, come agoaspirato o biopsia
• Prelievo indiretto: transita attraverso zone contaminate, come l'urina
• Prelievo da siti colonizzati: bisogna considerare la presenza di microbiota residente, come nella faringe
• L'interpretazione dei risultati è influenzata dalla presenza di microbiota residente
• Si utilizzano terreni di coltura selettivi per isolare specifici microrganismi
• La raccolta deve avvenire nel momento più appropriato: fase acuta della malattia e prima della terapia antibiotica
• Bisogna attendere almeno 72 ore dopo l'ultima somministrazione di antibiotici
• È necessario raccogliere una quantità di materiale biologico sufficiente, e utilizzare contenitori sterili, integri e ben chiusi, con identificazione tramite etichetta
• Il trasporto deve avvenire a temperatura ambiente (20-25°C) per emocoltura, liquor, feci, TV, TOC e TO (MO termosensibili come STPN, NEM, NEGO, HAIN, SA)
• Durante il trasporto, urine, feci, espettorato e BAL se non immediatamente inviati al laboratorio vanno refrigerati a 4-6°C
• In caso di terreni liquidi, semisolidi (Stuart, Amies, Cary-Blair) o con conservante (parassiti), è necessario il confezionamento anaerobico
• DPI è importante a causa del rischio biologico
• Bisogna verificare la conformità del contenitore e del campione, comunicare eventuali ripetizioni o integrazioni dati tra reparti e laboratorio

Diagnosi Microbiologica: Metodi diretti e indiretti

• Metodo Diretto identifica l'agente patogeno o parti di esso (antigeni, acidi nucleici, prodotti metabolici, tossine)
• Metodo Diretto comprende osservazione microscopica, indagine colturale, ricerca di antigeni e tossine, saggi molecolari
• Metodo Indiretto dimostra la presenza di una risposta immunitaria specifica (anticorpi, linfociti reattivi)
• Metodo Indiretto comprende test immunologici antigene/anticorpo
• Con IgM si identificano infezioni transitorie (eccezionalmente 6-12 mesi)
• Con IgG si identificano infezioni trascorse (4-6 settimane e persistono talvolta per tutta la vita)
• Bisogna prestare attenzione nei pazienti anergici o immunocompromessi
• Il metodo indiretto è utile per MO difficili da isolare o per ricercare infezioni pregresse
• Il metodo indiretto comprende reazioni di precipitazione/agglutinazione, fissazione del complemento/inibizione dell'emoagglutinazione, reazioni immunoenzimatiche (IF, ELISA, WB), e produzione di INF-ɣ

Esame Microscopico e Colturale

• La colorazione (Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa) fornisce informazioni sul tipo di MO, sulla morfologia, sulla disposizione e sulla reattività al colorante
• L'esame microscopico ha scarsa sensibilità e specificità, e non rileva virus
• L'esame colturale consiste nella semina del materiale in terreni di coltura selettivi per la crescita di batteri/funghi
• La valutazione quantitativa dipende da come viene seminato il campione
• L'identificazione di genere e specie avviene grazie a test enzimatici e biochimici, con tempi medi di 24/48 ore
• La spettrometria di massa (MALDI-TOF) permette l'identificazione basata su proteine ribosomiali, con tempi medi di 12/24 ore
• La coltura è fondamentale per valutare la sensibilità ai farmaci (antibiogramma/antimicogramma)
• Le colture cellulari si utilizzano per l'isolamento di virus, ma non tutti sono coltivabili

Ricerca di Antigeni e Tossine Microbiche

• Si basa sulla reazione antigene-anticorpo (Ag-Ab)
• Nell'agglutinazione su particelle di lattice, le particelle inerti sono rivestite di Ab specifici verso l'Ag MO da ricercare, con formazione di immunocomplessi visibili
• Un esempio è la ricerca di Ag polisaccaridici della capsula batterica per la diagnosi di meningite nel LCR
• Il saggio immunoenzimatico ELISA rileva/dosa Ag o Ab, sia direttamente che indirettamente
• Ag e Ab sono fissati in micropiastra, e si utilizza un marcatore enzimatico come fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano
• Il cambiamento di colore indica una reazione positiva e la presenza di Ab

Saggio Immunocromatografico su Membrana

• È un saggio a flusso laterale che combina cromatografia e reazione immunochimica
• Il campione migra per capillarità e la lettura avviene tramite le bande di controllo e test
• Trova impiego nella diagnostica di SARS-CoV-2

Saggi Molecolari

• Identificano il MO mediante sequenze geniche specie-specifiche
• Sono più sensibili e specifici dei saggi tradizionali
• Particolarmente utili per MO non coltivabili, a crescita lenta o pericolosi
• Molte tecniche si basano sull'amplificazione del DNA mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) o RT-PCR
• L'analisi dei frammenti avviene per dimensione, sequenziamento, ri-amplificazione (nested-PCR) o ibridazione con sonde marcate
• Si utilizzano ampiamente l'ibridazione con sonde, la PCR end-point e la PCR real-time
• L'ibridazione del DNA utilizza brevi filamenti di DNA/RNA marcati che ibridano in modo complementare il genoma del MO
• Il legame alla sonda viene rilevato tramite segnale luminoso o viraggio del colore
• La Polymerase Chain Reaction (PCR) aumenta il numero di copie di una sequenza nota di acido nucleico
• Necessari DNA/RNA target, primer complementari, dNTPs ed enzima Taq-polimerasi
• Reazione in 45 cicli con denaturazione, appaiamento/annealing e sintesi del nuovo filamento

PCR Real-Time

• È una PCR quantitativa che permette di quantificare il target contenuto nella fase di amplificazione
• Si aggiungono composti la cui fluorescenza è proporzionale alla quantità di amplificato
• La cinetica di reazione è proporzionale alla quantità iniziale di templato
• Si utilizzano software dedicati che applicano algoritmi matematici per la quantificazione
• È il metodo di elezione per quantificare le viremie (HCV, HBV, HIV, CMV, EBV) nei soggetti trapiantati e immunodepressi

Diagnosi Microbiologica Indiretta Approfondimento

• Si basa sulla dimostrazione di una risposta immunitaria specifica (Abs, linfociti reattivi) tramite test immunologici antigene/anticorpo
• Utilizza antigeni noti per rilevare la presenza di anticorpi specifici
• IgM indica infezioni transitorie (6-12 mesi)
• IgG indica infezioni pregresse (4-6 settimane e persistono per tutta la vita)
• La sierologia valuta il TIMING e il DECORSO dell'infezione
• Utilizzata per MO difficile da isolare o infezioni pregresse
• La reazione di PRECIPITAZIONE/AGGLUTINAZIONE consiste nella formazione di immunocomplessi visibili
• La FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO/INIBIZIONE DELL'EMOAGGLUTINAZIONE sfrutta l'attivazione del complemento
• Le reazioni immunoenzimatiche comprendono immunofluorescenza, ELISA e Western blot
• La PRODUZIONE di INF-ɣ, come nel test QUANTIFERON, indica una risposta immunitaria cellulare attiva alla tubercolosi

Reazione di Precipitazione/Agglutinazione

• Si basa sulla formazione di immunocomplessi (Ag-Ab)
• Si utilizza per diagnosticare malattie infettive o identificare MO in base agli Ag che possiedono
• Se Ag solubile (es. tossina batterica) si ha una reazione di precipitazione (fine)
• Se Ag corpuscolato (es. proteina superficiale batterica) si ha una reazione di agglutinazione (ammassi voluminosi)
• Ag e Ab sono messi in contatto in soluzione acquosa con elettroliti
• Si determina il titolo precipitante, ovvero la più piccola quantità di siero che fa precipitare una quantità fissa di Ag
• Esempi sono la reazione di Widal (ID Ab per Salmonella typhi) e di Wright (ID Ab anti-brucella)

Reazione di Fissazione del Complemento

• Il complemento, una cascata di precursori inattivi attivati, interagisce tramite via classica (Ag-Ab), alternativa (LPS/galattomannani) o delle lectine
• IgG/IgM legate all'Ag fissano il C e causano la lisi di globuli rossi
• Il test di fissazione del C evidenzia la formazione di immunocomplessi aggiungendo siero paziente, Ag, Ab e GR.
• Se manca emolisi, la reazione è positiva
• Se si verifica emolisi, la reazione è negativa

Reazioni Immunoenzimatiche

• Sono dirette (Ag) o indirette (Ac)
• Il test EIA (Enzyme Immuno Assay) sfrutta il legame Ag-Ab per legare selettivamente una molecola ricercata
• Utilizzano una reazione enzimatica per produrre un segnale colorato misurabile
• Sono specifici e sensibili

Immunofluorescenza

• Utilizza Ab coniugati con molecole fluorescenti (FITC) che emettono radiazioni nel visibile dopo assorbimento di luce UV
• Si utilizza il microscopio a fluorescenza
• Ab lega a fluoresceina in modo diretto
• Ab specifico coniuga l'Ag ricercato e riconoscimento da secondo Ab conugato direttamente VS Fc nella specie del primo Ab, in modo indiretto

Immunoblot

• Rientra tra i test più specifici
• Individua una proteina target in una miscela di proteine separate tramite elettroforesi
• Le proteine separate per peso molecolare e carica elettrica sono trasferite su nitrocellulosa e incubate con Ab specifici
• Ab anti-Ig umani marcati con perossidasi sono aggiunti per legarsi all'immunocomplesso
• La visualizzazione avviene mediante aggiunta di substrato con precipitazione del colorante
• Un esempio è il WB, utilizzato come test di conferma per la diagnosi di HIV1 e HIV2