Colture cellulari: introduzione e storia

Ecco le note di studio dettagliate sul testo fornito:

Le colture cellulari

• Le colture cellulari sono sistemi artificiali in cui le cellule vengono prelevate dal loro ambiente naturale, disgregate e fatte crescere in un ambiente controllato.
• L'ambiente di coltura deve riprodurre le condizioni di crescita dell'ambiente di origine (temperatura, gas, nutrienti, isotonicità).
• L'obiettivo è che le cellule continuino a svolgere le loro funzioni specifiche e si accrescano per un tempo limitato o indefinitamente.
• Le colture di cellule disperse rappresentano il grado estremo di dissociazione di un organismo pluricellulare.
• La storia delle colture cellulari è strettamente legata allo sviluppo delle tecniche di coltura in vitro ed è relativamente recente.
• Roux esegue i primi espianti mantenendo il cervello di un embrione di pollo in una soluzione salina calda per pochi giorni.
• Harrison effettua esperimenti con colture di cellule animali non a caldo, usando midollo spinale di anfibio cresciuto su coagulo di linfa, dimostrando che le fibre nervose sono estensioni delle cellule nervose.
• Rous mantiene in vita cellule embrionali di pollo in soluzione salina, isolando prima tessuti/organi.
• Carrel mantiene porzioni di tessuto animale di 1-2 mm in terreni specifici in condizioni simili a quelle fisiologiche, sviluppando le prime tecniche di propagazione in serie.
• Earle ottiene le prime linee continue di cellule di mammifero.
• Gey isola e propaga una coltura cellulare tumorale, ottenendo la linea HeLa.
• Rita Levi Montalcini scopre l'esistenza del Nerve Growth Factor.
• Eagle individua gli elementi nutritivi essenziali per il mantenimento di una coltura cellulare (il "medium").
• L'uso delle colture cellulari è diventata una pratica comune nella ricerca a partire dagli anni '50, grazie al miglioramento tecnologico e delle tecniche di sterilità.
• Le colture cellulari sono ottimi modelli di studio perché la cellula è la più piccola entità vivente da cui si può risalire al funzionamento dell'organismo.
• Inoltre, riducono l'uso di animali e possono essere utilizzate in diverse branche della scienza, sia nella ricerca di base che in quella applicata.
• Vantaggi delle colture cellulari:
  • Rappresentano un materiale di studio abbondante e omogeneo.
  • Possono essere congelate (crioconservazione) e recuperate a distanza di anni.
  • Evitano o riducono il sacrificio di animali.
  • Permettono di controllare le condizioni di crescita.
  • Sono economiche e rapide nella risposta.
  • Esistono banche pubbliche di linee cellulari.
  • Sono utilizzabili con sistemi robotizzati.
• Svantaggi delle colture cellulari:
  • Sono sistemi semplificati rispetto a un organismo integrato, quindi i risultati in vitro non sono sempre applicabili in vivo.
  • Le cellule tumorali hanno una natura diversa da quelle in vivo.
  • Possibile contaminazione con altri tipi cellulari, batteri, virus o micoplasma.

Tipologie di colture cellulari

• Principalmente si distinguono in:
  • Colture di microrganismi (batteri, lieviti).
  • Colture di cellule eucariotiche di mammifero (e di tessuti animali), a loro volta suddivise in:
    • Primarie: isolate direttamente da tessuti o organi, con caratteristiche simili a quelle in vivo ma vita limitata;
    • Secondarie;
    • A Termine/Continue: derivanti da colture primarie.
• Fonti di cellule:
  • Animali/uomo: isolate da fluidi biologici (sangue) o per espianto/biopsia e successiva dissociazione cellulare.
  • Banche cellulari: forniscono cellule già estratte, con documentazione sull'assenza di contaminanti e condizioni di crescita (ATCC, DSMZ, ECACC, JCRB).
• Vantaggi delle banche cellulari: facile acquisizione, assenza di contaminanti, documentazione dettagliata, certificato di garanzia.
• È necessario un accordo (MTA) per il trasferimento di materiale tra laboratori, specificando gli usi del materiale.

Colture cellulari primarie

• Per ottenere colture primarie è necessaria una licenza approvata dal Comitato Etico.
• Si dividono in:
  • Colture d'organo: porzioni di organo sezionato non disgregato, mantenute in atmosfera satura di vapore e condizionate con CO2.
  • Colture di tessuto: espianto di tessuto trasformato in un monostrato, senza disgregazione.
  • Colture di cellule disperse: cellule sopravvissute alla disgregazione che aderiscono al substrato e crescono separate.
• Le colture primarie animali possono essere ottenute da diversi tessuti.
• Fasi per l'ottenimento di cellule primarie:
  • Prelievo del tessuto;
  • Disgregazione meccanica o enzimatica;
  • Inibizione della digestione enzimatica;
  • Separazione dei tipi cellulari.
• Nella disgregazione bisogna eliminare grasso e tessuto necrotico, usare strumenti adatti, inibire e eliminare gli enzimi e usare un terreno ricco.
• Il materiale di coltura può provenire da tessuti con capacità proliferativa diversa.
• Le cellule possono derivare da embrioni o adulti.
• Possono essere isolate da tessuto normale (colture primarie a vita limitata) o tumorale (linee cellulari continue con vita illimitata).
• Le colture cellulari primarie sono linee cellulari a termine, che dopo un numero limitato di generazioni possono morire o divenire linee cellulari continue, acquisendo capacità tumorali.
• La vita delle linee cellulari dipende dal numero di duplicazioni cellulari, non dal tempo di coltura.
• Le cellule, tranne quelle del sangue, devono aderire a un substrato.
• Per evitare la morte, si effettua una subcoltura.
• Le cellule possono diventare:
  • Linee cellulari a termine, se crescono fino alla morte;
  • Linee cellulari continue, se crescono illimitatamente e diventano immortalizzate; si originano da un espianto tumorale o per trasformazione casuale/indotta.
• Le linee continue presentano vantaggi (crescita infinita) ma svantaggi (modello diverso da quelli in vivo, alterazioni morfologiche e del cariotipo).
• Esistono 5 metodi di immortalizzazione: spontanea, chimica/fisica (radiazioni UV), trasformazione virale (geni virali), hTERT (human telomerase reverse transcriptase), ibridomi (fusione di cellule differenziate e tumorali).

Cellule staminali

• Sono cellule primitive non specializzate capaci di generare cellule figlie identiche o differenziate.
• Caratteristiche: autorinnovamento e potenza.
• Si dividono per mitosi, mantenendo una cellula staminale e differenziando l'altra in base a segnali esterni.
• In base alla potenza: totipotenti, pluripotenti, multipotenti, unipotenti.
• In base alla fonte: embrionali, fetali, amniotiche, adulte.
• Le cellule staminali embrionali e fetali servono alla formazione dell'organismo, mentre quelle adulte assicurano il ricambio cellulare.
• Le iPSC sono cellule staminali pluripotenti indotte ottenute riprogrammando cellule somatiche, usate in terapia cellulare.
• La riprogrammazione consiste nell'indurre la cellula somatica a esprimere i fattori Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Мус.
• Le iPSC derivano da cellule somatiche adulte, isolate per biopsia o prelievo.
• I loro limiti sono: tempi e costi di mantenimento, alta variabilità, instabilità genomica, mantengono modifiche epigenetiche.

Laboratorio di colture cellulari

• I requisiti fondamentali sono: protezione del prodotto (sterilità), dell'operatore e dell'ambiente.

Protezione del prodotto

• I contaminanti principali sono batteri, lieviti, muffe, micoplasma (piccoli batteri senza parete cellulare, non visibili al microscopio).
• Il micoplasma è determinato al microscopio a fluorescenza dopo trattamento con composti fluorescenti o con PCR.
• I contaminanti competono per i nutrienti, secernono sostanze acide o degradano componenti essenziali.
• Se la coltura è contaminata, bisogna trattarla con antibiotici/antimicotici o scartarla.
• Per lavorare sulle colture cellulari, tutto il materiale deve essere sterile.
• La sterilizzazione è la distruzione di tutte le forme microbiche e delle spore.
• La disinfezione è l'eliminazione di microrganismi, non di spore.
• Metodi di sterilizzazione:
  • Filtrazione con filtri da 0,2 µm su materiale liquido termolabile.
  • Calore su materiale solido non termolabile (mezzo più sicuro, rapido ed economico).
• Con il calore, la sensibilità varia in base al contenuto di H2O.
• La sterilizzazione può essere:
  • A calore secco (materiale metallico o di vetro esposto alla fiamma o in stufa a temperature maggiori).
  • A calore umido (materiale di vetro, gomma, plastica, ferri chirurgici, etc, in autoclave a 121°C, con pressione di 1 atm).
• Sostanze volatili e solventi non devono essere messi né in autoclave né in stufa.
• Nel processo di sterilizzazione si distinguono 3 fasi: riscaldamento, regime e raffreddamento.
• Per verificare la sterilizzazione si usano nastri adesivi termosensibili.
• Si usano raggi UV e gamma su materiale monouso e agenti chimici.

Protezione dell'operatore

• Le fonti di rischio sono: aerosol, linee cellulari di primati, tipi cellulari usati per l'analisi di patogeni, reagenti chimici.
• L'operatore deve indossare DPI (camice, guanti in lattice/nitrile).
• Conoscere il grado di rischio del materiale biologico per definire le vie per evitare/minimizzare il rischio.
• Gruppi di rischio: Gruppo 1 (bassa probabilità di causare malattie e disponibili profilassi efficaci), Gruppo 2 (possono causare malattie nell'uomo, con basse probabilità di propagazione), Gruppo 3 (possono causare malattie gravi), Gruppo 4 (possono causare malattie gravi con un alto rischio che si propaghino).

Attrezzature necessarie

• Le cappe sterili di sicurezza biologica proteggono il materiale di lavoro, l'operatore e l'ambiente dall'esposizione a aerosol e creano zone sterili.
• Creano al loro interno un flusso laminare di aria sterile, filtrata da filtri HEPA.
• I filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air) prevengono la contaminazione particellare.
• I filtri HEPA hanno un'efficienza del 99,97-99,99% e si dividono in:
  • Cappe a flusso verticale (efficacia dipendente dal flusso dell’aria, capacità di contenimento ed integrità dei filtri HEPA).
  • Di Classe I (proteggono l’operatore, non proteggono il campione).
  • Di Classe II (ventilate, aperte frontalmente e progettate per proteggere i prodotti al loro interno, l’operatore e l’ambiente, anche se in ingresso).
  • Di Classe III (ermeticamente chiuse e funzionanti ad una pressione negativa).
• I filtri a flusso orizzontale non proteggono l’operatore e l’ambiente ma solo il campione, e quindi non è un dispositivo di protezione collettiva.
• Le lampade UV sono per la sterilizzazione dell'ambiente interno.
• Agiscono per trasformazioni fotochimiche delle pirimidine del DNA cellulare.
• Gli incubatori mantengono: T=37°C per la crescita delle cellule di mammifero; umidità al 95% ; CO2 al 5%.
• Il bagnetto termostato serve per riscaldare i terreni di crescita.
• I microscopi ottici sono microscopi rovesciati a contrasto di fase che permettono l’osservazione di cellule vive e la valutazione del loro stato di proliferazione.
• Le centrifughe sono usate per il mantenimento di colture cellulari.
• La vetreria sterile è fatta di vetro normale(o pyrex).
• La plastica monouso è sterilizzata con radiazioni gamma.

Il Mantenimento di colture cellulari

• Acqua.
• Aminoacidi.
• Vitamine.
• Ioni inorganici.
• Carboidrati.
• Supplementi organici.
• Ormoni e fattori di crescita.
• Le variazioni di pH sono causate soprattutto della CO2 prodotta con il metabolismo cellulare.
• Il tampone con il NaHCO3 cerca di contenere la diminuzione del pH dovuta alla produzione di C02.
• Il tampone smette di funzionare quando il metabolismo cellulare è molto attivo, perciò bisogna cambiare il terreno con un nuovo tampone.
• Bisogna usare i flask vent.
• Si usano altri sistemi tampone: HEPES e MOPS.

Le tipologie di terreni

• MEM (Minimum Essential Medium).
• DMEM (Dulbecco's Modification of MEM).
• RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium).
• L-Gln.
• Antibiotici (penicillina, streptomicina).
• Siero.
• FBS (Fetal Bovine Serum deriva da taglio cesareo).
• Inattivato al calore per distruggere eventuali molecole del complemento e immunoglobuline.

Il metodo di coltura

• Colture in sospensione- Le cellule crescono senza aderire a un substrato ed hanno bisogno di volumi di terreno di coltura elevati.
• Coltura in adesione per cellule di vertebrati . Devono avere l’ interazione dei recettori di membrana con le proteine adesive sulla superficie da coltura. I substrati possono essere trattati o non trattati. il supporto delle piastre sono in polistirene. Le fibreectina e la vitronectina permettono l’adesione di diversi tipi cellulari.

Il ciclo e la curva del ciclo di crescita

• La densità di semina.
• Il tempo di crescita.
• La durata di un esperimento.
• Il momento adatto per il prelievo del campione ed il metabolismo cellulare.
• La fase LAG avviene l’adattamento al substrato ed alle nuove condizioni.
• Nella fase LOG le cellule crescono esponenzialmente.
• Nella fase PLATEAU le cellule diventano confluenti.

Il cambio del terreno

• Ogni coltura cellulare ha un tempo di raddoppiamento, perciò serve sapere qual è il tempo di raddoppiamento affinché la si possa mantenere nella fase ottimale di crescita.
• Il terreno va cambiato: Quando il pH diminuisce; Con l’aumentare della concentrazione cellulare; In base ai tipi cellulari e alla morfologia cellulare.
• La subcoltura si effettua poco prima della fase di plateau. Si rimuove il terreno di coltura consumato, Il distacco delle cellule dal substrato.

La conta cellulare

• Durante una subcoltura bisogna contare le cellule presenti.
• La stima ad occhio è poco indicata.

La coltura 3D

• Microambienti artificiali in cui le cellule crescono .
• Mimando una condizione più simile a quella fisiologica, La superficie per la coltura è coperta da un sottile film di substrati inerti.
• HANGING DROPS che sfruttano la tensione superficiale di un liquido e la forza di gravità.
• Hydrogels .gel con polimeri Idrofili ad alto contenuto di acqua . Le cellule sono iniettate sui matrigel.
• I bioreattori: Le camere hanno un’agitazione continua, poichè contengono sistemi di flusso terreni per garantire la circolazione dei nutrienti.
• Scaffolds, : Strutture sintetiche 3D formatee con diversi materiali che mimano la matrice extracellullare e forniscono. Vi è lo stampaggio in 3D.

Valutazione della vitalità

• Saggi di vitalità/Mortalità cellulare. I test di citossicità misurano la tossicità della di una sostanza chimica sopra le cellule.
• Esistono saggi sull’integrità della membrana: Colorazione con trypan blu; Colorazione con calceina-acetossimetile; Colorazione con ioduro di propidio.

Saggi sul metabolismo cellulare

• Allarme-Blu.
• Saggio MTT.
• Test dell’ATP.

Saggi di proliferazione cellulare

• Saggi di valutazione cellulare si basano:
• Sul contenuto di Dna.
• Sull’analisi Sintesi di Dna.

La conservazione del materiale biologico in azoto liquido

• Questo avviene a bassa temperatura (sotto i -60 gradi) in azoto liquido che risulta essere inerte, incolore ed inodore.
• Le cellule sono poste in contenitori adeguati e congelate lentamente.
• Il congelamento ottimale dipende dalla minimizzazione nella formazione di cristalli di ghiaccio e dalla riduzione dei danni criogenici. Quindi:
• Congelare lentamente le cellule.
• Usare un crioprotettore idrofilo.
• Conservare le cellule alla temperatura più bassa possibile.
• Scongelare rapidamente per ridurre al minimo la crescita dei cristalli di ghiaccio.
• In una sospensione cellulare ad alta concentrazione staccare dal substrato centrifugando per isolare le cellule e sedimentandole.
• Aggiungere il crioprotettore e successivamente in un contenitore con Isopropanolo.
• Trasferire in un congelatore per una notte e trasferire le cellule in azoto liquido.
• Recuperare la provetta con il materiale biologico ad interesse dal contenitore di azoto liquido, scongelare velocemente a 37 gradi e rimuovere il crioprotettore mediante centrifugazione a bassa velocità.
• Aggiungere del terreno fresco ricco di siero e seminare in un contenitore per colture cellulari.

Il Come ingegnerizzare cellula

L’ Ingegnerizzazione di una cellula eucariotica consiste nell'inserire DNA-RNA esogeno. Quindi, si analizza il dna e si studiano le funzioni.

Trasfezione

Intervengono 2 componenti.

• Cargo: La molecola di DNA-RNA da inserire nella cellula target.
• Vettore: Il metodo usato per veicolare il cargo all’interno. Tanti tipi di Cargo dipendono all’ingegnerizzazione:
• Dna plasmidico.
• Fago lambda.
• mRNA.
• ASO oligonucleotidi antisenso.

Il plasmide è una molecola a DNA circolare

• Origine di replicazione batterica.
• Marcatore selettivo.
• Sito di clonaggio polylinker. Per l’espressione dei nei mammiferi occorre:
• Un origine di replicazione batterica è virale.
• Il promotore del gene ad esprimere.
• C DNA di interesse.
• Terminatore di trascrizione.
• Marcatore selettivo per cellule di mammifero.

I metodi fisici

• La microiniezione serve per la manipolazione di singole cellule inserimento di dna /rna. Metodi balistici servono per colpire il dna di particolari cellule
• Con l’elettroporazione si usa un impulso elettrico.

Vettori virali

Devono essere modificati in modo che si riescano a riprodursi autonomamente generando virus defettivi. Si purificano le particelle virali e si usano nell’interesse. L’impossibilità di generare nuovi virus e una scarsa efficienza sono problematici. Esempio vi è l’Adenovirus e gli adeno-associati.

Metodi Chimici

• DEAE
• destrano DEAE -destrano.
• Calcio Fosfato ,in cui dna ed calcio precipitano.
• La lipofezione dove i liposomi hanno una carica positiva.

Micorscopia a fluoresecenza

• Fluorescenza è quando le onde emesse sono maggiori allo onde assorbite. La Lampada fornisce l’energia per l’eccitazione.
• Filtro di eccitazione che seleziona le lunghezza d’ onda.
• Specchio dicroico è una camera per visualizzare.
• La lampada può essere ad alta energia con vapori di MERCURIO o XENO.

Fluoreofori

• Gfp Fluorescente green protein
• Abs è un anticorpo . Ci si può avvallere del segnale di risonanza (fret) interazione. Per studiare il movimento si può vedere con il FRAp

Spero che queste note di studio ti siano utili!