Clonación y Secuenciación de ADN TEST Mixto

Unidad Didáctica 7: Determinación de las Técnicas de Clonación y Secuenciación de ADN

• La unidad aborda la clonación y secuenciación de ADN, incluyendo sus objetivos, componentes, tipos de vectores, fases, y aplicaciones en bioinformática, diagnóstico clínico, medicina legal y forense.

Objetivos

• Comprender el funcionamiento y la fusión de la bioinformática.
• Conocer los métodos de secuenciación del ADN y aprender a realizar análisis en el secuenciador.
• Comprender la importancia de los métodos de biología molecular en el diagnóstico clínico.
• Conocer las aplicaciones de los métodos de biología molecular en medicina legal y forense.

1. La Clonación

• Clonación se refiere a la inserción de secuencias de ADN en un plásmido (vector) para replicar secuencias génicas y manipular genes.
• La clonación molecular amplifica in vivo secuencias de ADN genómico o ADNc mediante la tecnología de ADN recombinante.
• La clonación in vitro tiene cuatro etapas: restricción, ligación, transformación y selección.
• Restricción: Enzimas de restricción cortan el ADN y el plásmido, generando extremos romos.
• Ligación: ADN ligasas aparean fragmentos de ADN de doble cadena.
• Transformación: Se introduce material genético en una célula o vector, alterando genéticamente la célula.
• Selección: Se seleccionan células que han incorporado el ADN pasajero a través de la infección de una bacteria y cultivo.

Ventajas de la Clonación

• Permite obtener cantidades ilimitadas de la secuencia de interés, incluso para secuencias de ADN grandes.
• Posibilita clonar el genoma completo en un único proceso.
• Facilita la expresión de genes de interés para aplicaciones industriales, producción de proteínas, hormonas, investigación y medicina.

1.1. Componentes de la Clonación

• Componentes principales: vectores de clonación y células hospedadoras.
• Los vectores son moléculas de ADN que se replican automáticamente en una célula huésped, permitiendo la inserción de ADN extraño.
• Características de los vectores:
  • Pequeño tamaño para fácil manipulación.
  • Origen de replicación para replicarse en la célula hospedadora.
  • Marcadores de selección, genes de resistencia a antibióticos, para seleccionar células transformadas.
  • Secuencias diana únicas para enzimas de restricción.
  • Secuencias dentro de un gen con función indicadora que, al interrumpirse, producen un cambio fenotípico.

1.2. Tipos de Vectores

• Vectores se diferencian por: origen de la molécula, disposición de elementos y tamaño del fragmento de ADN extraño.
• Plásmidos: Pequeñas moléculas de ADN circular en bacterias, replicándose independientemente y transmitiendo genes de resistencia a antibióticos.
• Bacteriófagos (Fagos): Virus que infectan bacterias, introduciendo su material genético. Pueden actuar por ciclo lítico o lisogénico.
• Cósmidos: Moléculas de ADN circular que combinan características de plásmidos y fagos, replicándose autónomamente y permitiendo el empaquetamiento in vitro.
• Fagémidos: Vectores compuestos por un plásmido y el origen de replicación de un fago filamentoso, permitiendo la producción de ADN monocatenario.
• Cromosomas Artificiales: Vectores de clonación para transportar fragmentos grandes, adecuados para la construcción de genotecas genómicas (BAC y YAC).
• Vectores Lanzadera: Vectores híbridos con orígenes de replicación de dos hospedadores diferentes (bacteria y levadura o virus animal).

1.2.1. Células Hospedadoras

• Células hospedadoras: donde se introduce el vector de clonación para su amplificación.
• Se cultivan con el vector en el medio adecuado para replicarse y dar lugar a células hijas con la misma carga genética.
• Las células hospedadoras pueden ser:
• Bacterianas: más utilizadas por su fácil manipulación, versatilidad y rapidez de crecimiento.
• Eucariotas: levaduras (crecen similar a bacterias) y células vegetales y animales (para determinados vectores).

1.3. Fases del Proceso de Clonación

• Tres fases: creación de un vector recombinante, introducción del vector en la célula hospedadora y selección e identificación de clones recombinantes.

1.3.1. Creación de un Vector Recombinante

• Vector recombinante: contiene un inserto de ADN extraño. Se prepara el ADN a clonar y el vector de clonación.
• Se dota a un ADN bicatenario de extremos cohesivos mediante una enzima de restricción compatible con el vector a utilizar.
• Preparación del vector: se digiere con la misma enzima de restricción.
• Posibilidades:
  • Vector circular con diana de restricción única: se transforma en molécula lineal con extremos cohesivos.
  • Vector circular con dos dianas de restricción: dos moléculas lineales, una con marcadores genéticos y otra sustituida por el ADN extraño.
  • Vector lineal con diana de restricción única: se divide en dos fragmentos, uno romo y otro cohesivo.
  • Vector lineal con dos dianas de restricción: se divide en dos fragmentos, uno romo, otro cohesivo y una región central sustituida por ADN extraño.
• Inserción del vector extraño: se mezclan e incuban ambos con ADN ligasa para unir a través de extremos cohesivos.

1.3.2. Introducción del Vector en la Célula Hospedadora

• Depende de la célula hospedadora y el tipo de vector.
  • Transformación bacteriana: Captación e internalización de ADN desnudo por bacterias competentes (E. coli).
  • Transfección: Introducción de vectores recombinantes en células eucarióticas sin virus.
  • Transducción: Introducción de material genético extraño por virus (fagos recombinantes o cósmicos).
  • Electroporación: Pulsos eléctricos de alto voltaje a la mezcla de células y vectores.

1.3.3. Selección e Identificación de Clones Recombinantes

• Tras la introducción se obtienen tres tipos de células: no transformadas, transformadas (con el vector recombinante específico), y transformas (con vector no recombinante).
• Proceso de selección es condicionado por los marcadores genéticos del vector
• Sistemas de selección:
  • Genes de resistencia a antibióticos: vectores con genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina.
  • Estrategia cromogénica: bacterias hospedadoras defectivas lac- y vectores con gen de resistencia al antibiótico y gen lacZa.
  • Proteínas fluorescentes: gen de resistencia y gen que codifica una proteína fluorescente (GFP).
• Genes letales: gen de resistencia a un antibiótico y gen que codifica para una proteína letal.

1.3.4. Tasa de Transformación

• Es la medición de la eficiencia de la introducción del vector en la célula hospedadora.
• Tasa de transformación = (UFC x VT) / (C x VS)
  • Donde VT es el volumen total de la solución, C la cantidad de vector, VS el volumen de suspensión bacteriana y UFC las unidades formadoras de colonias. Expresada como número de células transformadoras por µg de vector.

2. La Bioinformática

• Bioinformática: aplicación de tecnología informática, matemáticas y estadística a la gestión y análisis de datos de métodos de análisis masivo (ómicas).
• Ómica: medición o análisis completo de genoma, exoma, proteínas (proteómica), transcritos (transcriptómica), metabolitos (metabolómica).
• En el análisis de genes de toda una población celular, la bioinformática es esencial debido a la gran cantidad de datos.
• Objetivos de la bioinformática:
• Organizar los datos en bases de datos (BBDD), permitiendo acceso a la información y publicación de nuevos datos. La curación de datos es una tarea esencial.
• Desarrollo de herramientas y recursos para facilitar el análisis de datos (ej. programas como BLAST).
• Utilizar estas herramientas para analizar e interpretar los resultados, lo que ha revolucionado los estudios biológicos.
• Aplicaciones: Medicina molecular, estudios evolutivos, terapia genética, desarrollo de fármacos.
• Prácticas:
• Encontrar homólogos: Buscar similitudes entre diferentes moléculas.
• Diseño de fármacos: Búsqueda de nuevos medicamentos basados en el conocimiento de una diana biológica.

3. Técnicas de Secuenciación de ADN

• Secuenciación: conocer la secuencia de nucleótidos (A, T, C, G) en la doble hélice de ADN. Los cuatro bases químicas se unen siempre con la misma pareja.

Secuenciación Tipo Sanger

• Fue desarrollado en 1977 y es la técnica más empleada.
• Es un método enzimático que permite determinar la secuencia del molde a medida que se sintetiza su hebra complementaria.
  • Un ADN de cadena sencilla que actúa como molde.
  • Un cebador para iniciar la síntesis de ADN.
  • Los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (datp, dgtp, dctp y dttp).
  • La enzima ADN-polimerasa.
  • Los cuatro didesoxirribonucleótidos trifosfato (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) que son utilizados por la ADN polimerasa para construir la nueva hebra pero, una vez incorporados, impiden la adición de nuevos nucleótidos.
• La secuenciación se lleva a cabo en cuatro tubos. Cada tubo contiene el molde, el cebador, los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP), la polimerasa y un didesoxirribonucleótido trifosfato (ddNTP) distinto en cada caso.
• En cada tubo, cuando la ADN polimerasa incorpora aleatoriamente un ddNTP la reacción se detiene, de manera que se generan fragmentos de distinta longitud, todos ellos con el mismo ddNTP terminal.
• Los diversos fragmentos se separan en función de su tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, una técnica que permite separar fragmentos de ADN cuya longitud difiere en un sólo nucleótido.

• Mediante esta tecnología, se puede determinar la secuencia de moléculas de ADN de hasta 800 nucleótidos de longitud.

Secuenciación Alelo-Específica por Bisulfito

• Es una variación de la secuenciación Sanger que se emplea para la identificación de metilaciones alelo-específicas.
• Entendemos como metilación el mecanismo que es capaz de bloquear la expresión de un gen a través de la hipermetilación de los nucleótidos en zonas concretas (islas CpG).
• Se basa en la desnaturalización para segregar las dos hebras del ADN. Después es incubado con sulfito 15-20 horas.
• El compuesto tiene la capacidad de transformar las citosinas del ADN en uracilo; aun y así, no puede alterar las que se hallen metiladas.
• El último paso es la amplificación de la región a mapear por PCR y su secuenciación.

Pirosecuenciación

• Es una técnica para secuenciar el ADN en tiempo real. Está basada en la liberación de los pirofosfatos (PP).
• La pirosecuenciación es un método enzimático que permite determinar la secuencia de una molécula de ADN Componentes:
  • Un ADN de cadena sencilla que actúa como molde.
  • Un cebador para iniciar la síntesis de ADN.
  • Tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dgtp, dctp y dttp) más desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (datp•S, un derivado del datp que puede ser utilizado normalmente por la ADN-polimerasa pero que no es reconocido por la luciferasa) Cuatro enzimas:
  • ADN polimerasa (que cada vez que añade un nuevo desoxirribonucleótido trifosfato a la cadena naciente genera una molécula de PPi), ATP sulfurilasa (que convierte el PPi en ATP en presencia de APS), luciferasa (que, en presencia de ATP, convierte la luciferina en oxiluciferina y genera un fotón de luz visible)
  • apirasa (que degrada los nucleótidos que no se han incorporado a la cadena naciente y el ATP generado por la sulfurilasa).
  • Adenosina 5'-fosfosulfato (APS).
• Luciferina.

Secuenciación Masiva

• Gracias al desarrollo en el estudio del genoma humano, los métodos clásicos de estudio están siendo sustituidos por las técnicas de secuenciación masiva o NGS (Next Generation Sequencing).
• La NGS puede emplearse para:
  • Secuenciación de genoma completo o del exorna (solo las partes codificantes), 1-2 %.
  • Paneles de genes para determinar enfermedades hereditarias.
  • Paneles con genes seleccionados para grupos de enfermedades no hereditarias.
  • Paneles con genes seleccionados para terapias dirigidas (farmacogenética).

4. Otros Exámenes con el Secuenciador

• El secuenciador automático o el aparato de electroforesis capilar sirven para la detección y cuantificación de la fluorescencia mediante 2 tipos de análisis:
• Análisis de fragmentos: se utiliza para determinar los genotipos y evaluar la pérdida de heterogeneidad e inestabilidad de microsatélites.

MLPA

• Es una variante del PCR múltiple que diseña primeros adyacentes y tan solo si ambos hibridan se unen en un cebador para la amplificación.
• El secuenciador automático es relevante clínicamente, un campo donde tiene las siguientes funciones:
  • Reordenamientos de inmunoglobulinas o receptor T para observar si una lesión es linfoma o de ganglio reactivo.
  • Detección de las alteraciones genéticas a causa del cambio de la medida de un gen (delecón, inserción, etc.).
  • Detección de la inestabilidad de microsatélites.

5. Aplicación de Biología Molecular

• La secuenciación de diferentes axones de un gen con tal de determinar mutaciones diagnósticas o dianas terapéuticas se aplica a los usos clínicos mencionados anteriormente.
• Utilización en:
  • Diagnóstico molecular en enfermedades infecciosas.
  • Diagnóstico molecular en cáncer.
• Diagnóstico molecular del tipo point of care.

6. Aplicaciones en Medicina Legal y Forense

• En el campo de la medicina legal y forense, los métodos de análisis masivo pueden complementarse con otras aplicaciones, como se ha visto con anterioridad.
• Los SNP arrays (Single Nucleotids Polimorphism) son matrices que se emplean para la identificación de variantes individuales.
• Tienen la habilidad de determinar polimorfismos de un solo nucleótido; por lo que suelen ser empleadas en este campo.
• Aplicaciones en bases de datos genéticas en medicina legal y forense:
  • Programa FÉNIX. Identificación de cadáveres y restos humanos tras guerras, problemas socio-políticos y desastres en masa.
  • Iniciativa DNA-PROKIDS. Iniciativa para luchas contra el tráfico de seres humanos, especialmente niños.
  • Aplicaciones en muestras antiguas.
  • Identificación de personajes históricos.

• Biorrecuperación de especies.
  • Caracterización de elementos históricos.
  • Aplicaciones en biomedicina.
  • Caracterización de muestras provenientes de tumores.

• Asociación de enfermedades a haplotipos genéticos.