BM UD9. Clonación de Ácidos Nucleicos

Unidad 9 - Clonación de Ácidos Nucleicos

• El análisis de los ácidos nucleicos requiere una cantidad apreciable para aplicar técnicas de Biología Molecular y Genética
• La amplificación se logra mediante PCR o clonación molecular

Métodos de Clonación Molecular

• La clonación molecular es la amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o ADNc basada en tecnología de ADN recombinante
• Se crean moléculas de ADN recombinante que se introducen en una célula huésped, que al multiplicarse en cultivo, generan copias del ADN recombinante
• Se introduce un fragmento de ADN (inserto) en una molécula de ADN (vector) que se replica autónomamente
• Se obtienen así millones de copias de una clona molecular compuesta por ADN del inserto y el vector

Proceso de Clonación Molecular:

• Inserción del fragmento de ADN a amplificar en un vector
• Introducción del vector recombinante en una célula viva hospedadora
• Selección y multiplicación en cultivo de las células que portan el ADN recombinante
• Recuperación del fragmento amplificado

Ventajas de la Clonación Molecular:

• Permite obtener cantidades ilimitadas de la secuencia de interés
• Permite clonar secuencias de ADN grandes (millones de pares de bases)
• Permite clonar el genoma entero de un organismo en un único proceso, facilitando la creación de librerías genómicas
• Permite la expresión de genes, con aplicaciones industriales como la producción de proteínas y hormonas

Componentes de la Clonación

• Los componentes principales de la clonación molecular son los vectores de clonación y las células hospedadoras

Vectores de Clonación o Vectores Moleculares

• Son moléculas de ADN que se replican autónomamente en una célula huésped, permitiendo la inserción de ADN extraño sin perder su capacidad de replicación
• Actúan transportando fragmentos de ADN a clonar dentro de células huésped, donde se replican
• El ADN de interés introducido en el vector se llama inserto
• Los vectores que transportan un inserto se denominan vectores recombinantes

Características de los Vectores de Clonación:

• Debe tener un sitio de inserción de ADN extraño, llamado polylinker o sitio de multiclonación, que son secuencias diana de enzimas de restricción
• Los vectores modernos tienen múltiples dianas de restricción para insertar casi cualquier ADN extraño
• Debe tener un origen de replicación que le permita replicarse en la célula huésped junto con el fragmento de ADN extraño
• Debe contener un marcador de selección para distinguir las células que portan el vector, generalmente genes de resistencia a antibióticos

Tipos de Vectores:

• Los vectores se diferencian por el origen de la molécula, la disposición de sus elementos, y el tamaño del fragmento de ADN que pueden incorporar
• Los más utilizados son plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos y cromosomas artificiales

Plásmidos:

• Son moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico bacteriano con replicación autónoma
• Su tamaño varía, dado que el número de plásmidos por célula depende del peso molecular del plásmido
• Mediante ingeniería genética, se han diseñado vectores plasmídicos que mejoran su capacidad de clonación

Requisitos para elegir un Plásmido Idóneo:

• Bajo peso molecular para mayor número por célula y facilidad de manejo y purificación
• Fenotipo fácilmente seleccionable (como resistencia a un antibiótico) para distinguir clones portadores
• Capacidad de aumentar artificialmente el número de copias por célula, facilitando la amplificación

Plásmidos Utilizados:

• pBR322: bajo peso molecular, con genes de resistencia a antibióticos, transporta fragmentos de ADN pequeños (20 copias por célula)
• pUC18: derivado de PBR322, pequeño, inserta hasta 10 kb y tasa de replicación de hasta 500 copias por célula

Estructura de Plásmidos

• El plásmido pBR322 tiene un origen de replicación (ori), genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina, y dianas de restricción
• El plásmido pUC18 tiene un origen de replicación, gen de resistencia a ampicilina, gen LacZa y un polylinker o Multiple Cloning Site (MCS)

Bacteriófagos:

• Los bacteriófagos o fagos infectan bacterias
• El fago introduce su material genético en la bacteria, se adueña del control metabólico, replica su cromosoma vírico, sintetiza proteínas víricas, empaqueta nuevos virus y los libera al medio
• Algunos fagos insertan su material genético en el cromosoma bacteriano por recombinación, como el fago lambda (fago A), que puede incluir insertos de hasta 20 kb

Cósmidos:

• Son vectores híbridos con parte del cromosoma del fago A y parte del cromosoma bacteriano (plásmidos)
• Contienen secuencias "COS" del fago A, un origen de replicación de plásmido, un gen de resistencia a antibióticos y un polylinker
• Los extremos COS del fago lamda son complementarios y se emplean para la recirculalización
• Admiten insertos de hasta 50kb

Fagémidos, Fagómidos o Fásmidos:

• Son vectores híbridos con un plásmido (con origen de replicación bacteriano) y el origen de replicación del fago M13
• En la célula hospedadora se comporta como un plásmido, pero produce ADNmc (monocatenario)
• Se infecta la célula hospedadora con M13, para que las proteínas del virus reconozcan el origen de replicación del fagémido e inicien una replicación de cadenas sencillas que salen al medio

Cromosomas Artificiales:

• Vectores de clonación que transportan insertos grandes, con gran capacidad son idóneos para construir genotecas
• Los más utilizados son los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) (insertos de hasta 300kb) y los cromosomas artificiales de levaduras (YAC) (inserto superior a 1Mb)

Vectores Lanzadera:

• Son vectores híbridos con orígenes de replicación de dos hospedadores diferentes, replicándose en dos organismos hospedadores distintos
• Se utilizan para transportar insertos entre hospedadores
• En el primer hospedador (E. coli), se amplifica el inserto, y en el segundo se expresa el gen amplificado

Células Hospedadoras:

• Las células hospedadoras amplifican el vector de clonación mediante replicación
• La célula hospedadora se cultiva en un medio adecuado, generando una progenie de células hijas con la misma carga genética (un clon)
• La elección de la célula hospedadora depende del vector de clonación y la finalidad perseguida

Células Hospedadoras Procariotas (Bacterias):

• Son las células más utilizadas para clonar plásmidos, fagos y cósmidos, pues su cultivo es fácil, rápido y económico
• Se suelen utilizar cepas defectivas carentes de actividad enzimática para favorecer la estabilidad de los vectores
• Suelen carecer de exonucleasas que degraden el vector y genes de control de la recombinación genética para evitar la integración del vector en el cromosoma bacteriano
• La bacteria más utilizada es E. coli (cepa K12). También se usan Bacillus subtilis y Streptomyces

Células Hospedadoras Eucariotas:

• Levaduras: organismos unicelulares que crecen similar a bacterias en medios sólidos y líquidos
• Permiten la clonación de fragmentos grandes, utilizados para clonar YAC y plásmidos de levadura
• La levadura más utilizada es Sacharomyces cerevisiae, aunque se usan Pichia, Hansenula o Kluyveromyces
• Células vegetales y animales: se utilizan para la expresión de genes extraños en un organismo transgénico
• En células vegetales, se utilizan vectores basados en el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, que vive en el suelo e infecta plantas produciendo tumores
• Las cepas infectivas tienen un plásmido Ti, que se transfiere a la célula vegetal integrándose en su ADN cromosómico, codificando para aminoácidos y hormonas
• Ti se usa como base para construir vectores de clonación en células vegetales
• Para células animales, se utilizan vectores víricos (derivados del genoma de baculovirus para insectos o retrovirus para mamíferos)

Fases del Proceso de Clonación:

• Creación de un vector recombinante
• Introducción del vector en la célula hospedadora
• Selección e identificación de los clones que portan la secuencia de interés

Creación de un Vector Recombinante:

• Un vector recombinante contiene un inserto de ADN extraño
• Se prepara el ADN a clonar y el vector de clonación, creando extremos cohesivos y complementarios para ligarlos

Creación de Extremos Cohesivos:

• Se trata el ADNbc con una enzima de restricción, que genera extremos cohesivos
• La digestión con una enzima de restricción genera múltiples fragmentos de tamaños diferentes

Clonación de un Único Gen:

• Se amplifica el ADN mediante PCR
• Las polimerasas sin corrección de errores generan amplicones con una A desapareada en 3' (residuos A), que se inserta en vectores con T desapareadas en 3' (vectores- T)

Digestión del Vector de Clonación:

• Vector circular con diana de restricción única: al tratarse enzimáticamente, se convierte en una molécula lineal con extremos cohesivos
• Vector circular con dos dianas de restricción: se obtienen dos moléculas lineales con extremos cohesivos, una grande con marcadores y otra pequeña que se sustituye por ADN extraño
• Vector lineal con una diana de restricción única: se divide en dos fragmentos o brazos, con un extremo romo y otro cohesivo
• Vector lineal con dos dianas de restricción (como el fago λ): se obtienen dos brazos con un extremo romo y otro cohesivo, sustituyendo una región central por ADN extraño

Inserción del ADN Extraño:

• Se mezclan ambos en concentraciones adecuadas, incubándolos para que se unan por los extremos cohesivos mediante complementariedad de bases
• En presencia de una ligasa, se sella covalentemente la doble hélice, produciendo el vector recombinante (ligación)
• Tras la ligación, se obtiene una mezcla compleja de vectores recombinantes, vectores recircularizados sin ADN y moléculas de ADN unidas entre sí

Introducción del Vector en la Célula Hospedadora:

• Existen métodos para introducir el vector recombinante en la célula hospedadora viva, dependiendo del tipo de vector y célula empleada

Transformación Bacteriana:

• La bacteria capta e internaliza moléculas de ADN desnudas del medio externo
• Solo las bacterias "competentes" pueden realizar este proceso, ya sea naturalmente o mediante técnicas
• Las bacterias competentes son frágiles y requieren manipulación cuidadosa
• La competencia natural se da en Streptococcus, Bacillus y Pseudomonas

Transformación de E. coli:

• Se transforma mediante un tratamiento químico con cloruro cálcico y un tratamiento físico de choque térmico
• Estos tratamientos aumentan la permeabilidad de la pared y membranas celulares
• Finalizado el protocolo, las bacterias se siembran en placas de medio de cultivo sólido para seleccionar clones recombinantes

Transfección:

• Es un proceso similar a la transformación bacteriana, pero en células hospedadoras eucariotas (principalmente animales)
• Se produce la producción de vectores recombinantes en células eucariotas no mediada por virus
• Transfección estable: el ADN se incorpora al genoma y se transmite a su progenie
• Transfección transitoria: el ADN no se integra al genoma y no se transmite en la división celular
• Se añade el vector recombinante en una solución tamponada de fosfato cálcico sobre un cultivo de células animales
• El vector coprecipita con el fosfato cálcico sobre las membranas celulares y se introduce por endocitosis
• Otro método eficaz utiliza liposomas, que se fusionan con las membranas celulares y liberan su contenido

Transducción:

• Se introduce material genético extraño en la célula mediante un virus
• El vector recombinante se empaqueta dentro de la cápside de un virus que infecta un cultivo de células hospedadoras
• En fagos A recombinantes y cósmidos, el empaquetamiento se consigue mezclando el vector con las proteínas de la cápside vírica
• Al infectar un cultivo bacteriano sensible, los viriones introducen el material genético en la bacteria infectada

Electroporación:

• Se aplican cortos impulsos de alto voltaje a una mezcla de células hospedadoras en suspensión y vectores recombinantes
• Estos pulsos aumentan la permeabilidad de las membranas, permitiendo el paso de los vectores al interior de la célula
• Se utiliza un electroporador para dar un pulso eléctrico que eleva el potencial eléctrico de la membrana celular

Selección e Identificación de Clones Recombinantes:

• Tras la introducción del vector, se obtiene una mezcla con células no transformadas, células transformadas con el vector recombinante y células transformadas con un vector no recombinante o ADN no deseado

Tipos de Células Transformadas:

• Células no transformadas: no han captado ninguna molécula de ADN
• Células transformadas: portan el vector recombinante
• Células transformadas: portan un vector no recombinante o ADN no deseado

Marcadores Genéticos:

• Los marcadores genéticos en el vector condicionan el proceso de selección: genes de resistencia a antibióticos, enzimas que producen reacciones coloreadas, proteínas fluorescentes, genes letales, etc.

Genes de Resistencia a Antibióticos:

• Se utilizan vectores con dos genes de resistencia a antibióticos (ampicilina y tetraciclina)
• El punto de inserción del ADN extraño interrumpe la secuencia de uno de los genes de resistencia
• Al introducir este vector en bacterias sensibles a ampicilina y tetraciclina se obtienen tres tipos de células:
  • Células no transformadas: sensibles a ambos antibióticos
  • Células transformadas con el vector recombinante: resistentes a ampicilina y sensibles a tetraciclina
  • Células transformadas con el vector no recombinante: resistentes a ambos antibióticos
• Se cultivan las células en un medio con ampicilina (solo crecen las transformadas) y se replica la placa en otra con tetraciclina
• Los clones recombinantes crecen en la placa con ampicilina y no en la que contiene tetraciclina

Procedimiento de Genes de Resistencia a Antibióticos:

• Placa original: las células transformadas crecen en un medio con ampicilina, solo las que tienen plásmidos forman colonias
• La placa original se presiona con terciopelo estéril transfiriendo células de cada colonia
• El terciopelo se presiona sobre una placa nueva con tetraciclina, las réplicas con insertos formados no haran colonia
• Si no crece colonia indica por la flecha indica iserto en el vector plasmídico
• Se identifica la colonia correspondiente de la placa original y se utiliza para nuevos análisis

Proteínas Fluorescentes:

• Se emplean vectores con un gen de resistencia y un gen que codifica una proteína fluorescente para identificación
• La región polylinker se incluye en el gen de la proteína fluorescente, de manera que los insertos inactivan el gen
• La proteína más utilizada es GFP (de una medusa)
• Las bacterias transformadas se seleccionan por crecimiento en medios con antibiótico, y se identifican iluminando las placas con luz ultravioleta
• Las colonias de bacterias transformadas con plásmidos no recombinantes presentan fluorescencia verde, mientras que las transformadas con plásmidos recombinantes no tienen fluorescencia

Genes Letales:

• Se utiliza resistencia a antibióticos como marcador de selección y un gen que codifica una proteína letal como identificador
• En vectores recombinantes, la proteína letal no es funcional porque el inserto de ADN extraño interrumpe la secuencia génica
• Se cultivan las bacterias en un medio con antibiótico, donde solo se desarrollan las bacterias con el vector recombinante
• Las bacterias no transformadas no crecen debido a la sensibilidad al antibiótico, y las transformadas con el vector no recombinante mueren por la proteína letal

Bibliotecas de ADN:

• Una biblioteca o librería de ADN es una colección de vectores recombinantes cuyas secuencias de ADN extraño se han obtenido de un único organismo

Tipos de Biblioteca de ADN:

• Bibliotecas genómicas: Colecciones de vectores recombinantes que incluyen el genoma completo de un organismo
• Se suelen realizar en fagos, cósmidos, BAC o YAC. Debe contener al menos una copia de cualquier secuencia del genoma. Se calculan base al tamaño y medio de los insertos clonados, dependiendo del vector utilizado. Se debe contener 8·105 clones
• Bibliotecas cromosómicas: ADN construidas a partir de un único cromosoma aislado
• Bibliotecas de ADNc: Se obtienen a partir del ARNm de un tejido o una población celular determinada Representan solo el subconjunto de genes de un organismo concretos en un tipo celular

Análisis de una Biblioteca de ADN:

• Al final del proceso, se obtiene una colección de miles o cientos de miles de clones en forma de colonias bacterianas, fagos recombinantes o colonias de levaduras

Pasos para Analizar la Biblioteca

• Identificación de Clones: Mediante hibridación o identificaciones inmunológicas
• Paseo Cromosómico: Permite localizar secuencia adyacente secuencia adyacente en la biblioteca obtenidas
• Se detecta clones los clones contenedores de la secuencia B y sucesivamente
• Se basa en digestión con un enzima de forma que la sonda se rastrea hasta la Biblioteca genómica
• Secuenciación: Consiste en descifrar la secuencia ADN

Aplicaciones de la Clonación Molecular:

• La clonación molecular facilita la obtención de cantidades ilimitadas de genes e integrarlos en el genoma de un organismo

Aplicaciones en Investigación:

• Clonación en vectores de expresión para la producción industrial de proteínas recombinantes
• Proteínas de interés médico (insulina, hormona del crecimiento, factor VIII)
• Proteínas de la industria química
• Enzimas y catalizadores
• Proteínas de interés medio ambiental
• Microorganismos capaces de metabolizar Hg, petróleo, etc.
• Insercion de genes en plantas/animales permite grandes avances y transferencias interesantes de caracter
• Permite organismos más resistentes y fértiles

Organismos Transgénicos (GMO):

• Organismos con genes nuevos o modificados sometidos a estricta legislación

Aplicaciones en Medicina:

• Creación de ratones transgénicos
• Terapia génica

Ratones Transgénicos:

• Ratones con ADN modificado (inserción o eliminación de genes)
• Fundamentales para la comprensión de enfermedades y su tratamiento

Tipos de Ratones Transgénicos:

• Ratones Knockout: se inactiva un gen determinado por delección o inserción de otro gen interrumpe la secuencia
• Permita estudiar el función analizandp el fenotipo
• Ratones Knockin: se sustituyen con normal con uno mutado mutaciones en de aminoácidos
• Se reproducen alteraciones en humanas o un para estudios oncogénicas

Terápia Génica:

• Se transfieren genes normales a células somáticas para corregir una enfermedad genética
• Se pretende que las células tratadas sinteticen el producto génico normal
• Estrictamente controlada por ética y legislativa
• No es ética en humanos
• Uso habitual consiste:
• La terapia de enfermedades monogénicas hereditarias (anemia falciforme o enfermedad de Huntington)
• La terapie de enfermedades adquiridas (cancer)
• El marcaje Génico (seguimientos de las células)