Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

• La chromatographie en phase gazeuse (CPG) sépare les mélanges de molécules en fonction de leur nature et volatilité.
• Elle est principalement utilisée pour les composés thermostables et gazeux, ou ceux qui peuvent être volatilisés par chauffage sans décomposition.

Principe de la CPG

• L'échantillon est vaporisé et injecté en tête de colonne.
• L'élution se fait avec un gaz inerte (phase mobile).
• Il n'y a pas d'interaction entre les molécules d'analyte et la phase mobile.
• La phase mobile transporte l'analyte à travers la colonne.
• La rétention des molécules dépend de la température et des interactions substance-phase stationnaire.

Types de chromatographie en phase gazeuse

• Chromatographie gaz-liquide (CGL) : séparation basée sur le partage de l'analyte entre une phase mobile et une phase stationnaire liquide.
• Chromatographie gaz-solide (CGS) : séparation où la phase stationnaire est un solide et le mécanisme de rétention est l'adsorption.

Influence de la température

• Il esr important d'éviter la destruction des molécules à analyser.
• Il ne faut pas dépasser la température maximale d'utilisation de la colonne.
• La programmation de température est utilisée pour modifier la sélectivité et la résolution.
• La température est le paramètre essentiel à optimiser.

Gaz Vecteur

• Le gaz vecteur doit être d'une grande pureté et d'une très faible viscosité.
• Il doit être inerte vis-à-vis des solutés et de la phase stationnaire.
• Les gaz les plus utilisés sont l'hélium (He), l'hydrogène (H2), l'azote (N2) et l'argon (Ar).
• La compatibilité avec le détecteur est importante ; par exemple, le catharomètre (TCD) nécessite un gaz avec une conductibilité thermique différente des solutés (H2 ou He), et le détecteur à capture d'électrons (ECD) utilise N2 ou un mélange argon/méthane.

Appareillage : Source de gaz

• Bouteilles pressurisées avec régulateur de pression (1-4 bars).
• Purification en ligne possible avec des filtres ou pièges.
• Générateurs (azote de l'atmosphère, hydrogène par électrolyse de l'eau).

Injecteurs et chambre d'injection

• Introduction de l'échantillon à analyser (préparé dans un solvant très volatil) dans la colonne après vaporisation
• Température de l'injecteur doit être supérieure à celle de la colonne.
• Possibilité d'injection manuelle ou automatique.

Types d'injecteurs

• Injecteurs à vaporisation directe
• Injection « on column »
• Injecteurs avec ou sans division « split – splitless »
• Injecteurs à température programmée
• Vannes d'injection pour échantillons gazeux
• Technique dite « espace de tête ou Headspace »

Injecteurs à vaporisation directe

• Les échantillons sont portés à une température élevée, dans la chambre de vaporisation.
• Le but est d'être volatilisés immédiatement et entraînés par le flux de gaz vecteur en tête de colonne.
• Ce type d'injecteurs est utilisé avec des colonnes remplies.

Injection « on column »

• Injection directe (0,5 à 1 μl) dans la colonne froide ou dans une pré-colonne sans vaporisation préalable.
• Méthode utilisée pour les échantillons fragiles ou de volatilité différentes.

Injecteurs avec ou sans division « split – splitless »

• Les colonnes capillaires nécessitent de faibles volumes d’échantillons (0,1 à 10 μl) et une faible capacité d'échantillon (1 à 10 ng soluté).
• Un système de dérivation de flux est utilisé pour éliminer une partie de l’échantillon avant d’entrer dans la colonne (« mode split »).
• Pour injecter des volumes plus importants (analyse de trace ou solution diluée), la vanne de division est fermée (« mode splitless »).

Injecteurs à température programmée

• La chambre d'injection est chauffée progressivement (20°C à 300°C en quelques secondes).
• L'injection est possible avec ou sans division, à froid ou à température élevée.

Vannes d'injection pour échantillons gazeux

• Minimisent les erreurs de volume d'injection.

Technique « espace de tête » ou Headspace

• Technique employée pour des composés organiques très volatils et résiduels
• Le processus fonctionne en chauffant les solutions en flacon scellés de 6 à 20 ml vers 60-90°C et en injectant la vapeur avec une seringue à gaz.
• Le soluté est en équilibre entre gaz et échantillon, défini par le coefficient de partage liquide/gaz (KD = CL / CG).

Colonnes en CPG

• Il existe deux types principaux de colonnes : les colonnes remplies (ou classiques) et les colonnes capillaires GOLAY.

Colonnes : Remplies

• CGL (colonnes gaz-liquide) : remplies de particules d'un support inactif avec une grande surface spécifique, poreux et imprégné d'une fine couche de phase stationnaire liquide (polyester de glycols, polyéthers de glycols, etc.).
• CGS (colonnes gaz-solide) : remplies de particules d'adsorbant (charbon actif, gel de silice, alumine, tamis moléculaire).

Colonnes : Capillaires

• La phase stationnaire est déposée sur la paroi interne de la colonne sous forme d'un film mince (0,1 à 5 μm).
• Ces colonnes n'ont pas de support particulier, offrant une meilleure efficacité à une même vitesse de phase mobile.
• Elles sont décrites par l'équation de Golay expliquant la diffusion en phase mobile, la résistance au transfert de matière dans la phase mobile et phase stationnaire.

Les colonnes capillaires

• Colonnes capillaires à film : WCOT (Wall-Coated Open Tubular), où la paroi interne est tapissée d'un mince film de phase stationnaire (PS) liquide.
• Colonnes capillaires en silice fondue : FSOT (Fused-Silica Open Tubular).
• Colonnes capillaires à fines particules poreuses : SCOT (Support-Coated Open Tubular), où la surface interne est imprégnée de fines particules poreuses (diatomite) recouvertes d'un mince film de PS liquide.
• Colonnes capillaires à fines couche d'adsorbant : PLOT (Porous-Layer Open Tubular), où la paroi interne est imprégnée d'une fines couche d'adsorbant (CGS).

Phases stationnaires

• Elles doivent être stables et avoir une tension de vapeur faible.
• Elles ne doivent pas donner des associations irréversibles avec les solutions à séparer.
• Le choix des phases stationnaires dépend de la température d'utilisation et de la polarité des composés à séparer.

Four

• Il s'agit d'une enceinte thermostatique pour maintenir la température de la colonne.
• Les analyses peuvent se faire en mode isotherme (température constante) ou en programmation de température.

Détecteurs

• Un détecteur est placé directement à la sortie de la colonne pour détecter la présence des substances dans le gaz vecteur à mesure de leur élution.
• La présence des substances modifie une propriété physique ou chimique du gaz vecteur.
• Le détecteur transforme ces variations en signaux électriques.
• Qualités d'un détecteur à considérer : bruit de fond faible, sensibilité maximale, seuil de détection faible, domaine de linéarité étendu, sélectivité et spécificité, temps de réponse faible.

Classification des détecteurs

• Selon la proportionnalité de la réponse : détecteurs produisant un signal proportionnel à la concentration instantanée (détecteurs différentiels) comme le catharomètre TCD et le détecteur à capture d’électron ECD, ou détecteurs produisant un signal proportionnel au débit massique (comme l'ionisation de flamme FID et le détecteur à photométrie de flamme FPD.
• Selon la sélectivité : détecteurs universels (détectent un grand nombre de substances) et détecteurs sélectifs (détectent un type particulier de substances).
• Selon le principe de mesure : détection directe (propriétés particulière de l’analyte) où aucun signal en absence de l’analyte, ou détection différentielle basée sur la différence de comportement du gaz vecteur et de l’analyte.
• Selon le pouvoir destructif : détecteur destructif ou non destructif.

Détecteur à conductivité thermique TCD (Catharomètre)

• Mesure la variation continue de la conductivité thermique du gaz vecteur pur par rapport à celui chargé de solutés.
• Choix limité pour les gaz vecteurs (He ou H2)

Détecteur à ionisation de flamme FID

• L'éluat est ionisé dans une flamme à 2100°C.
• Les composés organiques forment des ions collectés par deux électrodes, puis le signal est amplifié et transmis à l'enregistreur.

Détecteur à capture d’électrons ECD

• Spécifique aux composés à atomes électronégatifs (substances électrophiles).
• Le gaz vecteur, bombardé par rayonnement β (63Ni), émet des électrons.
• Les molécules ionisables captent ces électrons, diminuant le courant reçu par l'électrode.

Photométrie de flamme (FPD)

• Spécifique aux dérivés soufrés et phosphorés.
• Excitation des molécules dans une flamme et émission de photons.
• Les photons sont détectés par un photomultiplicateur.

Détecteur de masse

• Analyse des produits ionisés par impact électronique ou traitement chimique.
• Formation d’ions moléculaires et de fragments caractérisés par le rapport masse/charge (m/z).
• Le spectre affiche le nombre de fragments (abondance) en fonction du rapport m/z, caractéristique de la molécule.
• Le système informatique compare le spectre de l’analyse à une bibliothèque de données.

Dérivatisation en CPG

• La chromatographie en phase gazeuse sépare les composés gazeux ou vaporisables sans décomposition.
• La transformation préalable (dérivatisation) transforme les composés pour une meilleure séparation avant injection.
• La dérivatisation est nécessaire pour les substances non volatiles, thermolabiles ou ayant une faible volatilité.

Dérivatisation - Silylation

• Introduction d'un groupement silylé (triméthylsilyl -Si(CH3)3) TMS.
• Suppression des liaisons hydrogène et diminution de la polarité.

Silylation - Conditions

• Le milieu réactionnel doit être anhydre.
• L’échantillon ne doit pas contenir des solvants susceptibles de réagir avec le réactif silylant.
• Le temps et la température de réaction doivent être suffisants.
• Le réactif de silylation doit être en excès.

Dérivatisation - Alcoylation

• Alcoylation : remplacement d'un hydrogène mobile par un groupement alkyl (méthyl) ou aryl.

Dérivatisation - Acylation

• Fixation d'un groupement acyle (cation acylium).
• La fixation de groupements halogénés peut augmenter la sensibilité de détection (ECD).

Acylation - Conditions

• Le milieu réactionnel doit être anhydre et inerte.
• L’échantillon ne doit pas contenir des solvants susceptibles de réagir avec les réactifs (eau, alcool, …).
• La température de réaction doit être élevée.

Applications

• Analyse qualitative pour identifier et tester la pureté des composés organiques, en utilisant par exemple l'indice de rétention de Kovats.
• Analyse quantitative pour le domaine pharmaceutique (contrôle des matières premières et des préparations), le contrôle des gaz médicaux, et les études pharmacocinétiques.
• Analyse quantitative dans la recherche des impuretés (solvants résiduels).
• Analyse de toxicologie et en agroalimentaire et environnement.
• En biochimie avec l'hormonologie et l'analyse des acides aminés dans des liquides biologiques.