Analisi di laboratorio su campioni biologici

Campioni Biologici

• Il sangue è un fluido biologico comune per le analisi, prelevato da una vena del braccio.
• Il volume medio di sangue prelevato è di 5 ml.
• Viene raccolto in provette sottovuoto (vacutainer).
• Gli analizzatori automatizzati richiedono volumi di 2-100 μL per singola analisi.
• Altri fluidi biologici utilizzati includono urina, liquido cerebrospinale (CSF), liquido amniotico e saliva.
• Altri fluidi biologici utilizzati includono il liquido sinoviale (dalle cavità delle giunture), il liquido pleurico (dal sacco che circonda i polmoni) e il liquido pericardico (dal sacco che circonda il cuore).
• Il liquido peritoneale (ascitico) è utilizzato per l'analisi dall'addome.
• Diversi fluidi condividono analiti di interesse come glucosio e proteine, ma differiscono nelle proprietà chimiche/fisiche.
• Le differenze nelle caratteristiche dei fluidi definiscono le differenze delle matrici.
• I metodi per il plasma sanguigno potrebbero non essere idonei per altri fluidi.
• Verificare l'idoneità del metodo per il tipo di campione fluido.

Immunochimica

• Identifica metodi analitici sensibili e specifici per rilevare molecole di interesse.
• I Ligand Assay sono spesso basati sull'uso di un anticorpo (Ab) per identificare l'analita (antigene, Ag).
• La quantificazione dell'analita coinvolge un tracciante che, in determinate condizioni, rivela un segnale proporzionale ai complessi Ag-Ab formati.
• Le fasi nell'immunochimica includono l'incubazione per la formazione di complessi Ag-Ab.
• La separazione dei complessi Ag-Ab dalle molecole di Ab e Ag non reagite è una fase fondamentale.
• Si deve procedere con il rilevazione del segnale analitico.
• L'elaborazione dei dati e l'estrapolazione delle concentrazioni dell'analita sono l'ultima fase.
• Nei metodi competitivi, si usa un singolo Ab per identificare l'Ag in difetto di Ab/eccesso di Ag.
• Il segnale analitico è inversamente proporzionale alla concentrazione nel metodo competitivo.
• I metodi non competitivi prevedono l'uso di due Ab in eccesso di Ab/difetto di Ag.
• Il segnale è direttamente proporzionale alla concentrazione di Ag nel metodo non competitivo.
• Il dosaggio immunochimico ha tre componenti fondamentali. Essi sono: analita (Ag), molecola legante (Ab) e un tracciante.
• Il tracciante emette il segnale analitico in base al legame tra Ag e Ab.
• Gli Ag sono generalmente macromolecole (proteine, glicoproteine, polisaccaridi) con epitopi diversi.
• L'epitopo è la regione dell'Ag riconosciuta specificamente dall'Ab.
• Gli Ag che suscitano una risposta immunitaria sono chiamati immunogeni.
• Le molecole a basso peso molecolare (< 2 kDa) possono essere antigeniche ma non immunogene (apteni).
• Gli apteni devono essere legati a un carrier per indurre la produzione di Ab.
• I metodi immunochimici possono misurare qualsiasi analita riconoscibile e legato da un'altra molecola, inclusi Ab legati da Ab anti-Ab.
• La molecola legante è perlopiù un Ab.
• La specificità è la capacità di riconoscere l'analita tra molecole di struttura simile.
• L'affinità è un'altra caratteristica dell' Ab (Keq Ag-Ab)
• Gli Ab più comuni nei saggi immunochimici sono le IgG, che possono essere monoclonali o policlonali.
• Gli Ab monoclonali riconoscono un solo epitopo, mentre i policlonali riconoscono zone diverse.
• La specificità della misura immunochimica dipende dagli Ab usati come leganti.
• Gli Ab policlonali usati come leganti sono meno specifici rispetto agli Ab monoclonali.
• Gli Ab monoclonali hanno caratteristiche di affinità e specificità note e costanti.
• Piccole quantità di antigene sono sufficienti per la produzione di anticorpi monoclonali.
• È possibile selezionare gli anticorpi monoclonali con la specificità desiderata.
• Gli anticorpi monoclonali possono essere prodotti illimitatamente in quantità limitate.
• La purificazione degli anticorpi monoclonali è semplice.
• Gli anticorpi monoclonali sono caratterizzati da un'alta specificità.
• Gli anticorpi monoclonali possono avere una specificità eccessiva.
• Gli anticorpi monoclonali richiedono tecnologie più sofisticate per la produzione.
• Gli anticorpi monoclonali non reagiscono sempre con la proteina A (rilevazione indiretta supporti solidi-lega IgG).
• Gli anticorpi monoclonali non formano un precipitato in seguito a legame con l'antigene.
• Gli anticorpi monoclonali sono spesso caratterizzati da una bassa affinità.
• La rilevazione del segnale analitico nell'immunochimica è importante per la sensibilità (ordine nmoli e pmoli).
• Il tracciante indica la reazione analitica e la sostanza da misurare viene resa rilevabile con un marcatore che non altera il sistema.
• La porzione di Ag o Ab coniugata con il tracciante è definita marcata.
• In passato, si usavano solo traccianti radioattivi.
• Il legame chimico del tracciante con Ag o Ab deve avere la minima interferenza con la formazione del complesso Ag-Ab.
• Il segnale analitico emesso dovrebbe avere un'elevata intensità per unità di massa, dipendente dal limite di rilevabilità del tipo di tracciante.
• La specificità del segnale deve essere la più alta possibile per ridurre il rumore di fondo e migliorare la rilevabilità.
• Il segnale non dovrebbe essere modificato dalle caratteristiche della matrice circostante.
• La misurazione dovrebbe essere ripetuta, se possibile.
• Il tracciante deve essere rilevabile in un'ampia gamma di concentrazioni.
• Le caratteristiche del segnale analitico dipendono dalla natura del segnale stesso e dalla strumentazione usata.
• I traccianti possono essere raggruppati in categorie come radioattivi, enzimatici, fluorescenti e chemiluminescenti.
• Ogni categoria di tracciante ha una tipologia di segnale emesso diversa e richiede un tipo di rivelatore specifico per la misurazione.
• I radioisotopi emettono radiazioni γ o β e richiedono un contatore di radiazioni per la misurazione, con una massa (moli/tubo) di 0.1*10^-15.
• I fluoro fori emettono luce e richiedono un fluorimetro, con una massa (moli/tubo) di 10^-15 - 10^-18.
• Gli enzimi possono avere assorbimento luminoso, che richiede un fotometro, con una massa (moli/tubo) di 10^-15 - 10^-16.
• Gli enzimi possono avere emissioni luminose, che richiede un luminometro, con una massa (moli/tubo) di 10^-16 - 10^-18.
• Gli enzimi impiegano l'amplificazione ciclica, che richiede un luminometro, con una massa (moli/tubo) di 10^-20 - 10^-21.
• Le molecole luminogene possiedono emissioni luminose, che richiede un luminometro, con una massa (moli/tubo) di 10^-16 - 10^-18.
• Alcuni traccianti forniscono un segnale esplicito (radioattività, luminescenza), misurabile con strumenti idonei.
• Altri traccianti portano un segnale implicito (attività enzimatica, fluorescenza) che richiede un passaggio ulteriore per la misura.
• I traccianti radioattivi sono stati gli unici usati a lungo nello sviluppo e nell'esecuzione delle determinazioni di immunochimica.
• I due radio elementi principali usati come marcatori sono lo 125I (emette radiazioni γ) e il 3H (emette radiazioni β).
• I vantaggi dell'uso di traccianti radioattivi includono un segnale diretto, positivo, spontaneo e molto specifico.
• L'emissione del segnale è indipendente dall'ambiente e l'attività è proporzionale solo al numero di molecole marcate.
• Il segnale è contato numericamente e facilmente correggibile per il rumore di fondo.
• Nelle determinazioni immunoenzimatiche, la molecola marcata é un antigene o un anticorpo associato ad un enzima.
• La misura dell'attività enzimatica serve a valutare la quantità di marcato libero o legato nell'immunocomplesso.
• La quantificazione tramite l'aggiunta del giusto substrato, che innesta la reazione enzimatica.
• I marcatori enzimatici non emettono un segnale diretto, ma il segnale quantitativamente misurabile è proporzionale all'attività catalitica degli enzimi.
• La misura del segnale analitico dipende dal tipo di trasformazione sul substrato da parte dell'enzima può essere assorbanza o emissione di radiazioni luminose.
• Il segnale di radiazioni luminose di una reazione enzimatica si ottiene con diverse metodologie: uso di substrato cromogeno.
• Un cromogeno è una molecola la cui trasformazione catalizzata un enzima porta ad una modifica dello spettro di assorbimento.
• Un esempio é la reazione con perossidasi di rafano, con la formula: H2O2 + o-fenildiammina --> o-nitro-anilina + 2H2O.
• La perossidasi catalizza l'ossidazione del cromogeno e trasferisce gli e all'H2O2 che viene ridotto ad H2O.
• Il picco di assorbimento della o-Nitro-anilina è a 492 nm.
• L'utilizzo di un substrato cromogeno é un altro dei segnali di assorbimento tramite fosfatasi alcalina, con la formula: p-Nitro-fenilfosfato --> p-Nitrofenolo + Pi.
• Quest'ultimo, il p-nitrofenolo, ha un picco di assorbimento a 405 nm.
• Il segnale di emissione di radiazioni luminose di una reazione enzimatica può essere ottenuto con diverse molecole.
• L'utilizzo di un substrato fluorogeno come il B-D-galattosidasi: 4- Me-umbelliferil-ß-galacto-piranoside --> 4-Me-umbrelliferone, é una di queste.
• É presente fluorescenza nel 4-me-umbrelliferone.
• L'emissione di luce avviene anche tramite l'unione di due substrati, di cui uno luminogeno, reagendo con chemiluminescenza.
• Un luminogeno è una molecola la cui trasformazione produce un'emissione di luce reazione di chemiluminescenza.
• Vi é la perossidasi di rafano H2O2 + o-fenildiammina --> ione ammino ftalato + 2H2O, dove la reazione é: 2 H2O2 --> O2 + 2H2O.
• Il prodotto dell'emissione avviene a circa 425 nm.
• I traccianti fluorescenti (fluorofori) emettono onde elettromagnetiche a lunghezze d'onda maggiori rispetto a quelle ricevute tramite eccitazione con radiazioni nell'ultravioletto o nel visibile.
• I traccianti fluorescenti devono possibilmente emettere un segnale intenso e specifico.
• I fluorofori convenzionali come la fluoresceina emettono un segnale intenso ma poco specifico.
• Tanti fenomeni interferenti concorrono nell'aumentare il rumore di fondo ottico.
• Nelle determinazioni immunochimiche, un adeguato limite di rilevazione richiede un rapporto elevato tra il segnale e il rumore di fondo, che si ottiene con fluorofori che emettono un segnale intenso e misurabile.
• I traccianti chemiluminescenti sono molecole la cui eccitazione e la successiva emissione di radiazioni luminose derivano dall'ossidazione della molecola tramite apporto di energia chimica.
• I composti chemiluminescenti per l'immunochimica devo avere capacità di formare legami covalenti con le molecole da marcare.
• La reazione chimica che porta al legame non deve alterare l'immunoreattività del complesso.
• La chemiluminescenza non deve diminuire eccessivamente dopo il legame.
• Gli ftalizaridi (come il luminolo, l'isoluminolo ed i derivati) sostituiscono l'isoluminolosono.
• Esempio: Perossidasi, OH- / H2O2 + luminolo ione ammino ftalato + 2H2O +hv.
• Nella chemiluminescenza diretta, il tracciante é il substrato e si aggiugne al termine con perossidasi e perossido d'idrogeno.
• Nella formula indiretta, il tracciante é costituito con perossidasi, e substrato luminogeno viene insieme al perossido d'idrogeno in seguito.

Formazione Del Complesso Ag-Ab E Reazione Di Equilibrio

• Gli Ab sono proteine del gruppo delle Immunoglobuline. Gli Ab sono classificabili in 5 classi: IgG, IgA, IgM, IgE e IgD.
• Le IgG sono le più semplici a livello strutturale, ed hanno 4 catene polipeptidiche con 2 leggere e 2 pesanti.
• Il legame tra un Ag ed il corrispondente Ab porta alla formazione dell' immunocomplesso.
• L'unione é altamente specifica regolata da legami non covalente che agiscono tra i determinati dell'Ag e dell'Ab.
• I metodi immunochimici, sfruttando le proprietà selettive e di avidità dei legami Ag e Ab realizzano metodi specifici per quantificare l'analita in matrici complesse.
• L'avidità del legame Ag-Ab si misura con la cosatante di affinità Kaff, che é una una costante termodinamica di equilibrio Keq.
• Un Ab è idoneo per lo sviluppo di metodi immunochimici se ha un valore di Keq di 10^9-10^12 M^-1.
• Le Ka è la costante di velocità d'associazioni e Kd la costante di dissociazione.
• L'affinità dell'Ab con l'analita si determina con il diagramma di Scatchard, che si ottiene sperimentalmente con una quantità costante di Ab.
• La conc totale di Ab, Ab₁ = [Ab]eq + [AgAb]eq.
• Il diagramma di Scatchard riporta in ascisse la concentrazione di AgAb, e il rapporto fra Ag legato e libero.
• Le caratteristiche di un saggio immunochimico sono determinanti per valutare la sensibilità del metodo, e quindi l'intervallo analitico della concentrazione di Ag.
• Un Ab con una costante maggiore di affinità rispetto ad un altro, andrà a registrare un segnale piú intenso alla medesima concentrazione di Ag.
• I metodi immunochimici senza tracciente si usano per la formazione di complessi AgAb viene evidenziata direttamente, senza dover separare le forme di Ag e Ab non legate.
• I metodi Emoagglutinazione e Agglutinazione al lattice si basano sul principio dell'Agglutinazione.
• Metodi Come Rocket immunoelettroforesi, Immunoturbidimetria e Nefelometria si basano sul rincipio della Precipitazione.
• Metodi Come Resonant mirror biosensor eSurface plasmon resonance si basano sugli Immunosensori.
• In questi metodi, le concentrazioni dei complessi sonao evidenziabili anche ad occhio nudo.
• Per concentrazioni inferiori si va a sfruttare la deviazione della luce dovuta al legame, che può essere riflessa, rifratta e diffusa.
• Oltre all'assorbimento della radiazione, la luce ha la potenzialità di venire riflessa, rifratta e diffusa.
• La RIFLESSIONE è il fenomeno per cui un'onda, quando colpisce l'interfaccia tra differenti mezzi, cambia direzione e torna nel mezzo di provenienza.
• La RIFRAZIONE è la deviazione subita da un'onda quando passa da un mezzo ad un altro.
• La DIFFUSIONE (o scattering) è un fenomeno in cui le particelle vengono deflesse (cambiano traiettoria) a causa della collisione con altre particelle.
• La DIFFRAZIONE avviene quando un'onda incontra un ostacolo o una fenditura, che abbia dimensioni simili alla sua lunghezza d'onda.
• La luce può essere riemessa da una sostanza che la assorbe. Ciò avviene nella fluorescenza.
• L'assorbimento di sostanze disciolte avviene nella soluzione, come nell'assorbanza.

Turbidimetria E Nefelometria

• La maggiore concentrazione dell'analita comporta luce meno riflessa nella turbidimetria e più luce dispersa nella nefelometria.
• Turbidimetria e nefelometria sono le tecniche immunochimiche più utilizzate.
• Non richiedono l'uso di tracciante, ma valutano la luce diffusa da un sistema eterogeneo quale soln / sospensioni.
• Sono applicate a immunoprecipitazione in fase liquida.
• La luce cala drasticamente in intensità perché assorbita nella turbidimetria,
• La luce diffusa prevale nella nefelometria, e c'è opalescenza.
• Il fascio di luce colpisce le particelle nei colloidi.
• Le particelle sono grandi da disperdere radiazione da un raggio d luce, e osservatori laterali possono osservare.
• L'assorbimento della radiazione prevale sulla diffusione, e si usano colorimentri UV-VIS per l'intensità della luce trasmessa.
• La luce rilevata diminuisce all'aumentare delle particelle di analita.
• Il fenomeno della diffusione è molto più intenso per fasi disperse e si valuta la luce diffusa a novanta gradi rispetto alla radiazione incidente facendo misurazioni nefelometriche.
• Le misure sono condizionate da fattori come pH e presenza di interferenti, e si è più sensibile.

Spettroscopia Di Riflettanza

• Con la spettroscopia di riflettanza si misura la variazione d'intensità della luce riflessa in una reazione chimica.
• La riflettanza studia la luce in funzione alla lungezza d'onda diffusa e riflessa.
• La zona reattiva delimitata assorbe l'analita dal fluido tramite reazioni cromogene sui supporti in dry chemistry.
• L'intensità e la concentrazione si misurano quantitativamente alla fine.
• I vantaggi sono l'applicazione di reagenti su zone diverse del supporto, e reagenti nell stato secco.
• I reagenti possono essere stratificati e separati, risolvendo le loro componenti al momento degli analisi delle urine.
• Le zone reattive assorbono quantità standard di test.
• Molte applicazioni sono per glucosio, colestrerolo totale, colesterolo HDL, trigliceridi.
• Altre applicazioni sono per creatinina, enzimi come GOT (AST) e GPT (ALT), emoglobina, ed anaboliti e cataboliti nelle urine (ACIDO URICO).
• Il dosaggio qualitativo avviene per malaria, su sangue per determinazioni nei studi medici e veterinari.
• Tramite la dry chemistry (Kodak) si testano al letto del paziente tramite strisce.
• Per la teoria sulla spettrofotometria dry Kodak Ektachem (1986) é un apparecchio su vetrino a tecnologia secca su piccoli volumi di campione.
• Serve per la misurazione su elettroliti enzimi ed altri marcatori biochimici.
• Uno strato di diffusione distribuisce il campione uniformemente su la superficie della piastra, trattenendo molecole come lipidi pigmenti proteine.
• Uno strato di reagenti comprende tutti i reagenti specifici dove avviene la reazione (completa o parziale).
• Una membrana semipermeabile permette solo il passaggio del prodotto.
• uno strato indicatore contiene il reattivo finale.
• il supporto transparente viene letto con la fotometria (per riflessione)
• la determinazione delle urine avviene con l'applicazione semi-quantitativa in dry chemistry, dove un supporto imbevuto di un reattivo reagisce su una goccia di urina.
• Con fibre ottiche, la colorazione si rifletterà proporzionalmente.
• Il sistema agevole per l' eliminazione e rapido, vantaggiosa per la chimica secca.
• Monopolio, callibrazione rigido e sistema chiuso sono gli svantaggi.

Metodi tecnici di chimuca biochimica

• Il corso ha come obiettivo è fornire le conoscenze base sui metodi analitici di tipo chimico e biochimico impiegati nei laboratori biomedici.
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• I laboratori possono essere pluridisciplinari o specializzati, su una certa matrice biologica.
• Le aree sui quali le analisi e test posso essere effettuati sono siero, plasma, ematologia, coagulazione, accettazione campioni.
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• Il laboratorio aiuta il medico nella diagnosi, prognosi e screening di patologie.
• Il tecnico deve esser competente sulle variaibli in una misurazione ed I principi di funzionameto.
• È il laborista é in grado di valutare se una misurazione é veritiera.
• La misurazione é un processo dove si descrive una proprietà ed un fenomeno
• La misura é un insieme di un valore dell'unità con grado incerto.
• É importante sapere la grandezza.
• L' incertezza di misura caratteriza la zona di valori entro il quale un fenomeno può stare.
• Il processo di misuarazione deve essere eseguite correttamente con tutte le parti: individuazione, motivo, metodo.
• il metodo di misura può essere diretto o indiretto.
• Quelli diretti valutano uno ione tramite potenziometria.
• Quelli diretti misurano il criogenico tramite osmolalità.
• Quelli diretti possono ottenere i risultati meglio rapportoati con meno margine.
• Quelli indiretti richiedono il passaggio ed hanno un grado di incertezza e sono meno precisi.
• Bisonga sempre calibarare.
• É importante l'utilizzo di reagenti specifici e avere una calibrazione.
• Esiste la legge di Lambert Beer, dove l' intensitá della radiazone aumenta all'aumentare della profonditá.
• Esistono delle deviazioni dei fattori chimici e fisici dei test come la temperatura.
• I test devono usanze radiazioni monocromatiche.
• I test devono esser facili da ripetere e veloci.
• Per effettuare cio, é fondamentale sapere lunghezza d'onda, pH, e saper mascherare gli interferenti.
• I calibratori vanno usati tramite kit con curve.
• E IMPORTANTE CHE LA COMPOSIZIONE SI VICINA A QUELLA DI ESEMPIO.
• Le analisi misurano la concentrazione delle sostanze nel corpo umano e le confrontano con valori di riferimento.