Analisi del Latte e Tecniche di Laboratorio

Preparazione del campione

• I campioni alimentari liquidi possono essere analizzati direttamente o dopo diluizione.
• I campioni solidi devono essere omogeneizzati in un diluente appropriato per disperdere i microrganismi in modo da poterli analizzare.
• Il peso del campione da analizzare deve essere adeguato (10-25g).
• L'utilizzo di un omogeneizzatore (Stomacher) è necessario per lo sfibramento del campione.
• La durata dell'omogeneizzazione dipende dalla durezza e dalla consistenza del campione.

Soluzioni diluenti

• Le soluzioni diluenti sono utilizzate per le diluizioni decimali.
• Esempi di soluzioni diluenti includono: soluzione fisiologica (NaCl, H₂O), sale peptone o triptone (peptone/triptone, NaCl, H₂O) e soluzione di Ringer (NaCl, KCl, CaCl₂, NaHCO₃).
• L'utilizzo di diluizioni decimali permette di contare le UFC (Unità Formanti Colonie).

Diluizioni seriali

• Le diluizioni seriali sono necessarie per determinare la carica batterica.
• Si parte da un campione e si diluisce in modo decimale, ad esempio 1 ml di campione in 9 ml di diluente sterile.
• Si ripetono le diluizioni in modo da ottenere il range di diluizioni.
• Le diluizioni sono importanti per piastrare su terreno nutritivo e contare poi le UFC.

Analisi microbiologiche - campioni liquidi

• Il materiale occorrente include pipette sterili da 1 ml e tubi contenenti 9 ml di diluente sterile.
• Le operazioni comprendono prelevare 1 ml di campione liquido, trasferirlo in 9 ml di diluente sterile e omogeneizzare.
• Questo processo crea una diluizione 1/10 del campione.
• Le operazioni vengono ripetute per ottenere diluizioni decimali.
• È necessario utilizzare nuove pipette sterili per ogni diluizione.

Analisi microbiologiche - campioni solidi

• Il materiale occorrente comprende: pipette sterili, tubicontenenti 9 ml di diluente sterile, sacchetti per stomacher sterili e un omogeneizzatore stomacher.
• Operazioni relative ad un campione solido includono pesare 10 g di prodotto, in sterilità, aggiungere 90 ml di diluente sterile, omogeneizzare con l'omogeneizzatore, e prelevare 1ml omogenato.
• Si prosegue con le diluizioni decimali successive (10-2, 10-3).
• È necessario utilizzare sempre nuove pipette sterili per ogni diluizione.

Diluizioni seriali (considerazioni)

• La scelta del numero di diluizioni dipende dalla carica batterica presunta del campione.
• Possono essere piastrate le ultime tre diluizioni contabili.
• Se incerti sulla carica batterica, realizzare un range ampio di diluizioni.
• Piastre con >200 colonie non sono contabili

Tecniche di semina in piastra

• La tecnica per inclusione ("inglobamento") prevede di mescolare il campione con un substrato solidificabile.
• La tecnica di spatolamento ("spatolamento") prevede di distribuire l'inoculo su tutto il substrato in modo piatto.
• Entrambe le tecniche sono utili per piastrare campioni liquidi o solidi.

Incubazione delle piastre

• I parametri da scegliere per l'incubazione includono la temperatura, il tempo e le condizioni di anaerobiosi/aerobiosi.
• Tali parametri devono essere adeguati al tipo di microrganismi in esame

Unità Formanti Colonie (UFC)

• Le UFC sono aggregati di cellule che possono essere visti ad occhio nudo quando supera le decine di milioni.
• Tali aggregati rappresentano una colonia, ovvero cellule tutte uguali e derivanti da una cella madre presente nel campione e nel terreno di coltura.

Concentrazione

• Le piastre derivate dalle diluizioni seriali avranno un numero di colonie progressivamente inferiore.
• Solo le piastre con massimo 200 colonie vengono considerate valide per il calcolo finale.
• È fondamentale che ci siano un numero limitato di colonie su ogni piastra. Il numero massimo è limitato a 200 colonie, questo valore viene utilizzato per dare un risultato preciso e riproducibile.

Conta in piastra

• La conta in piastra si usa per calcolare il numero di UFC (Unità Formanti Colonie).
• Si considera il numero totale di colonie contate e la formula per ottenere il risultato finale, che tiene conto sia della prima che della seconda serie di diluizioni e dei fattori.