Análise de Proteínas e Enzimas

Análise de Proteínas e Enzimas

• A quantificação da proteína total pode acompanhar o processo de purificação a cada fracionamento.

Métodos Baseados no Tamanho Molecular

• Métodos de filtração a gel são usados para análise de proteínas.

Ultrafiltração e Diálise

• Moléculas de solvente passam através de uma membrana semipermeável.
• O movimento do solvente ocorre no sentido de menor concentração.
• A técnica tem utilidade na purificação de proteínas brutas e na concentração de proteínas.

Métodos Imunológicos

• Envolvem interações antígeno-anticorpo (Ag/Ab).
• Imunoglobulinas atuam como anticorpos.
• O antígeno é a substância reconhecida pelo anticorpo.

Teste ELISA

• Usado em interações antígeno-anticorpo.
• Há diversos tipos, incluindo ELISA direto, sanduíche e competitivo.
• A análise pode ser direta ou indireta.

Western Blots

• Usado em interações antígeno-anticorpo.
• A banda proteica é detectada por um anticorpo específico.

Análise de Hidratos de Carbono

• Identificação de açúcares redutores, que possuem grupos aldeído (-CHO) ou cetona (-CO) livres.

Açúcares Redutores

• Englobam glicose, galactose, frutose e maltose, mas não a sacarose.

Métodos de Análise de Hidratos de Carbono

• Usados em laboratórios e na análise alimentar, na biologia e em outros campos.
• Um dos princípios dos métodos é a reação de oxidação dos açúcares redutores.
• Cromatografia líquida e gasosa são utilizadas.

Reações de Oxidação e Redução

• Baseiam-se na reação de redução e oxidação.
• Elas resultam em um precipitado vermelho.

Método Ácido Dinitrosalicílico (DNS)

• Envolve a medição espectrofotométrica de amostras.

Teste de Fehling

• Fundamentado nas propriedades físicas das soluções ou no poder redutor dos açúcares simples.
• A quantidade de óxido de cobre (I) precipitado é determinada a partir de solução de cobre (II).

Processo Colorimétrico

• Acontece entre o açúcar redutor e o ião Cu2+.
• Ocorre na solução de Fehling ou de Benedict em meio alcalino e com calor.
• O ácido fórmico pode causar interferência.

Teste de Benedict

• Reagente de Benedict usado.

Método de Somogyi-Nelson

• Variação espectrofotométrica para análise de açúcares redutores.

Teste de Tollen

• Processo colorimétrico que ocorre com o ião Ag+.
• O nitrato de prata e amoníaco são os constituintes da solução de Tollen.
• A reação genérica é: 2 [Ag(NH3)2]+ + RCHO + H2O → 2 Ag(s) + 4 NH3 + RCO₂H + 2 H+

Comparação de Métodos

• Titulação envolve uma solução de sulfato de cobre quente, e utiliza azul de metileno como indicador.
• A reação não é estequiométrica, exigindo uma curva de calibração.
• A titulação é influenciada pelo tempo de reação, temperatura e concentração dos reagentes.

Cromatografia

• Uma técnica analítica para identificar e quantificar açúcares (mono-, di- e polissacarídeos).
• TLC (cromatografia em camada delgada) é um exemplo.

HPLC

• (Cromatografia Líquida de Alta Performance) é usada na separação de anómeros de açúcares.
• Condições variam em pH e temperatura para melhor separação.

Cromatografia Gasosa (GC)

• A técnica GC-MS faz a análise de éteres TMS de hidratos de carbono.

Quantificação de Lípidos

• Uma variedade das técnicas analíticas usadas permitem a análise de lípidos incluindo ácidos gordos, fosfolípidos, esfingolípidos, triglicerídeos e esteróides.
• TLC, GC-MS e LC-MS são as técnicas mais utilizadas.

Cromatografia em Camada Delgada (TLC)

• Pode ser usada para a separação/identificação de ceramidas.

Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massas (GC-MS)

• É usada com lípidos de baixo peso molecular (<500Da).
• É uma técnica usada predominantemente em análises rotineiras de lípidos, com detetor FID.

Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas (LC-MS)

• Usada para obter perfis lipídicos de alta resolução (intervalo de massa: 100-2000 Dalton).
• Pode envolver HPLC-Chip/MS, PLC/MS, UPLC/FT-MS ou LC-TOF/MS.
• Permite uma melhor separação da matriz e análise à temperatura ambiente.