Bio1 lez 2

Aminoacidi e Proteine

• Due molecole di amminoacido si legano tramite una reazione di condensazione.
• Questa reazione genera un legame covalente chiamato legame peptidico (un tipo di legame ammidico).
• Il prodotto risultante da questo legame è un dipeptide.
• La formazione del legame peptidico avviene nei ribosomi durante la sintesi proteica.
• Durante la reazione, il gruppo carbossilico di un amminoacido reagisce con il gruppo amminico di un altro, rilasciando una molecola d'acqua (condensazione).
• L'idrolisi è la reazione inversa, dove un dipeptide viene scisso nei suoi due amminoacidi costituenti, con la formazione di una molecola d'acqua.

Risonanza del Legame Peptidico

• Il legame peptidico può essere rappresentato con due formule limite, ottenute per risonanza.
• L'atomo di azoto ha una coppia di elettroni non condivisa che può spostarsi verso l'atomo di ossigeno.
• Questo crea un doppio legame tra carbonio e azoto (C=N).
• L'atomo di azoto che cede il doppietto acquista una carica positiva, mentre l'atomo di ossigeno acquista una carica negativa.
• Nessuna delle due formule limite è del tutto corretta perché gli elettroni sono delocalizzati.
• La formula più precisa mostra la parziale caratteristica di doppio legame.

Rigidità e Planarità del Legame Peptidico

• La presenza del legame peptidico rende la struttura rigida, impedendo la rotazione attorno al legame perché si vengono a creare interferenze steriche se ruotasse.
• Questo è dovuto al fatto che nella formazione del legame sono coinvolti orbitali p puri, e se il legame ruotasse gli orbitali perderebbero il loro parallelismo
• Il legame è planare, poiché tutti gli atomi coinvolti giacciono sullo stesso piano.

Configurazioni del Legame Peptidico

• Il legame peptidico può presentarsi in due configurazioni: trans e cis.
• Nella configurazione trans, i carboni alfa si trovano su lati opposti rispetto alla retta del legame peptidico.
• Nella configurazione cis, i carboni alfa si trovano dallo stesso lato.
• La configurazione cis è rara in natura a causa dell'ingombro sterico.
• La configurazione trans è favorita perché minimizza le interferenze steriche.

Legame Peptidico X-Pro

• Il legame peptidico X-pro si ha quando un amminoacido qualsiasi (X) si lega alla prolina.
• La prolina è l'unico amminoacido con un gruppo amminico secondario.
• In questo legame, l'amminoacido X fornisce il gruppo carbossilico e la prolina fornisce il gruppo amminico.
• Le configurazioni trans e cis sono entrambe possibili; le interferenze steriche sono presenti in entrambe le configurazioni a causa della catena laterale ciclica della prolina.
• Per ogni dipeptide formato da X e prolina, la configurazione trans è predominante (80-90%) rispetto alla cis (10-20%).

Caratteristiche Elettrostatiche del Legame Peptidico (Configurazione Trans)

• In configurazione trans, il legame peptidico è polarizzato.
• Il carbonio del gruppo carbonile ha una parziale carica positiva, mentre l'ossigeno ha una parziale carica negativa.
• L'azoto del gruppo amminico ha una carica negativa e l'idrogeno ha una carica positiva.
• Il legame peptidico ha le caratteristiche di un dipolo.
• Restano sempre due cariche elettriche alle estremità della catena: l'estremità N-terminale e la C-terminale, indipendentemente dalla lunghezza.
• Le estremità possono reagire formando un nuovo legame.

Catena Polipeptidica e Residui Amminoacidici

• L’ordine degli AA nella catena polipeptidica non è casuale, si parla infatti di catena principale o scheletro covalente o backbone (le catene laterali sono escluse dal backbone).
• Gli amminoacidi che compongono la catena polipeptidica sono chiamati residui amminoacidici.
• Questi residui non sono più amminoacidi intatti, poiché hanno perso atomi (molecole d'acqua) durante la formazione del legame peptidico.
• Il primo amminoacido della catena ha un gruppo amminico libero e costituisce l'estremità ammino-terminale.
• L'ultimo amminoacido ha un gruppo carbossilico libero e costituisce l'estremità carbossi-terminale.

Codici e Classificazione delle Catene Polipeptidiche

• Gli amminoacidi possono essere rappresentati con un codice a una lettera (es. Serina=S) o con un codice a tre lettere (Ser), utile per studiare sequenze di catene polipeptidiche.
• I biochimici classificano le catene polipeptidiche in base alla lunghezza:
  • Proteine: più di 50 amminoacidi.
  • Polipeptidi: meno di 50 amminoacidi.
  • Oligopeptidi: meno di 10-12 amminoacidi (tripeptidi, dipeptidi, pentapeptidi, ecc.).
• I chimici distinguono tra polipeptidi (solo amminoacidi) e proteine (amminoacidi più un gruppo prostetico).
• Anche i biochimici fanno questa distinzione:
  • Proteine semplici: solo componente peptidica.
  • Proteine coniugate: componente peptidica legata a un gruppo non amminoacidico.
• I chimici chiamano proteina coniugata semplicemente proteina, e proteina semplice, polipeptide.

Gruppi Prostetici

• I gruppi prostetici possono essere:
  • Lipidi: formano lipoproteine.
  • Glucidi: formano glicoproteine.
  • Gruppi fosfato: formano fosfoproteine (fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina).
  • Gruppo eme: formano emoproteine (emoglobina, mioglobina, citocromi).
  • Flavine: formano flavoproteine.
  • Ioni metallici: formano metalloproteine.

Funzioni delle Proteine

• Le proteine svolgono molteplici funzioni:
  • Catalitica: enzimi che accelerano le reazioni chimiche.
  • Regolazione: segnali come ormoni o fattori di trascrizione.
  • Trasporto: trasporto di ossigeno (emoglobina), ferro, ecc.
  • Riserva: fonte di energia (es. ferritina che immagazzina Fe2+).
  • Contrattili: miosina e actina per la contrazione muscolare.
  • Strutturale: componenti della matrice extracellulare (collagene) o del citoscheletro.
  • Difesa: anticorpi (immunoglobuline).
  • Adattatrici/scaffold: riconoscimento tra proteine nei sistemi di segnalazione intracellulare.
  • Esotiche: come la miracolina che modifica temporaneamente i recettori gustativi.

Caratteristiche Strutturali di Alcune Proteine

• Le dimensioni delle proteine variano notevolmente.
• L'insulina ha un peso molecolare di 5.733 ed è composta da 51 amminoacidi.
• La glutammina sintetasi ha un peso molecolare di 600.000 ed è formata da 5.616 residui amminoacidici.
• L'aumento del numero di residui amminoacidici corrisponde a un aumento del peso molecolare (Mr).
• Le proteine possono essere costituite da una o più subunità.
• Citocromo C, mioglobina e lisozima sono formate da una sola subunità.
• L'emoglobina e la glutammina sintetasi sono formate da più subunità.
• L'insulina nasce come singola catena polipeptidica, ma viene poi processata in due catene distinte.

Composizione in Amminoacidi delle Proteine

• La composizione amminoacidica indica la quantità di ciascun tipo di amminoacido presente in una proteina.
• Si studia idrolizzando una proteina purificata in acido cloridrico concentrato (6 M) a 110°C per 1-2 giorni in assenza di ossigeno. Questo porta alla rottura dei legami peptidici.
• Si ottiene una miscela di amminoacidi che viene analizzata quantitativamente con tecniche come la HPLC.

Influenza delle Catene Laterali sugli Amminoacidi

• La composizione di amminoacidi per le proteine può variare moltissimo.
• Le catene laterali incidono particolarmente sulle caratteristiche di acidità o basicità alla proteina.
• Gli istoni sono proteine basiche perché hanno un alto contenuto di arginina e lisina, che sono amminoacidi basici.
• A pH fisiologico, gli istoni hanno una carica netta positiva accentuata e interagiscono con gli acidi nucleici, che sono polianioni negativi.
• Alcuni amminoacidi ricorrono più frequentemente nelle proteine, come alanina, aspartato, glutammato, lisina e arginina.
• Amminoacidi voluminosi sono presenti in minore quantità, come triptofano e fenilalanina.
• Nel collagene la glicina rappresenta circa 1/3 degli amminoacidi.
• La prolina è importante, quantitativamente, nel collagene, a differenza di altre proteine.

Punto Isoelettrico

• Il punto isoelettrico (pI) di una proteina è il valore di pH al quale la proteina ha una carica elettrica netta pari a zero.
• Si utilizza la tecnica dell'isoelettrofocalizzazione per determinare il pI.
• In base al pI, le proteine possono essere classificate come acide, neutre o basiche.
  • Proteine con pI prossimo alla neutralità: neutre.
  • Proteine con pI a pH basico: basiche.
  • Proteine con pI a pH acido: acide.

Struttura delle Proteine

• La struttura delle proteine è complessa.
• La catena polipeptidica si ripiega nello spazio, formando diverse conformazioni.

Livelli Strutturali delle Proteine

• Esistono diversi livelli strutturali gerarchici:
  • Struttura primaria: la sequenza lineare degli amminoacidi.
  • Struttura secondaria: ripiegamenti locali (alfa eliche, foglietti beta).
  • Struttura terziaria: ripiegamento globale dell'intera catena polipeptidica.
  • Struttura quaternaria: associazione di più subunità polipeptidiche.
• I primi tre livelli sono comuni a tutte le proteine, mentre la struttura quaternaria è presente solo in alcune proteine.

Struttura Primaria

• La struttura primaria è la sequenza amminoacidica della proteina.
• E’ l'ordine in cui gli amminoacidi si susseguono, partendo dall'N-terminale e arrivando al C-terminale.
• Ciò è diverso dalla composizione amminoacidica, che indica solo quali amminoacidi sono presenti, non il loro ordine.

Struttura Secondaria

• La struttura secondaria è il ripiegamento a livello locale di brevi tratti della catena polipeptidica.
• Questo ripiegamento è solitamente molto ordinato.
• Esempi di struttura secondaria sono l'alfa elica e il filamento beta.

Struttura Terziaria

• La struttura terziaria è il ripiegamento globale e complessivo dell'intera struttura.
• Se la proteina è costituita da una sola catena polipeptidica, la struttura terziaria costituisce il massimo grado di ripiegamento.
• Alcune proteine sono formate da due o più catene polipeptidiche, in quel caso è presente un alto livello strutturale, ovvero la struttura quaternaria.

Struttura Quaternaria

• La struttura quaternaria si ha con l'associazione di più subunità, ovvero più catene polipeptidiche.

Struttura Primaria dell'Insulina

• L'insulina viene inizialmente sintetizzata dalle cellule beta del pancreas come una singola catena polipeptidica di 86 amminoacidi.
• Successivamente viene modificata tramite tagli proteolitici, che rimuovono una parte centrale della catena, il peptide C.
• Restano quindi due parti della catena originaria: il primo e l'ultimo tratto.
• Le due catene sono unite tra loro tramite legami disolfuro (ponti S-S) che si formano tra i gruppi SH delle catene laterali degli amminoacidi di cisteina.
• L'insulina possiede una struttura quaternaria generata da un processo di modificazione all'interno della cellula.

Evoluzione Molecolare

• Studiando la struttura primaria delle proteine, si possono fare importanti considerazioni sul processo evolutivo.
• il citocromo C è una piccola proteina che si trova in molti organismi ed è coinvolta nella catena di trasferimento elettronico a livello mitocondriale.
• Confrontando le sequenze del citocromo C in specie diverse, è possibile valutare quanto le molecole divergono.
• Alcuni residui amminoacidici sono invarianti (conservati) in tutte le specie e sono essenziali per la funzione o la stabilità strutturale della proteina.
• Modificazioni a questi residui invarianti portano alla formazione di un citocromo C non funzionante.
• Gli altri amminoacidi possono essere variabili o ipervariabili.
• Le modifiche avvengono a livello del DNA, vengono trascritte in mRNA e tradotte in proteine.
• Mutazioni a un amminoacido fondamentale rendono la proteina non funzionale e portano alla non sopravvivenza dell'organismo.
• Per esempio, il citocromo C dell'uomo è uguale a quello dello scimpanzé, ma differisce di 10 amminoacidi rispetto a quello della pecora.

Albero Filogenetico

• Analizzando gli allineamenti vengono studiate le strutture primarie di specie diverse per costruire un albero filogenetico.
• Nell'albero filogenetico si posizionano le varie specie sulla base delle differenze tra le sequenze dei loro citocromi C
• Minori sono le differenze più vicine sono le due specie.

Globine

• E' possibile studiare molecole estratte da un singolo organismo.
• Le globine sono catene polipeptidiche che entrano nella costituzione dell’emoglobina, che trasporta l’ossigeno e si considera anche la mioglobina che contiene sempre il gruppo eme, ma ha una funzione diversa, ovvero di deposito di ossigeno nelle cellule muscolari.
• Allineando le sequenze di varie globine umane e della mioglobina è stato creato un albero che riguarda l’evoluzione di un singolo gene e del suo prodotto ed è probabile che c’era una globina primordiale comune il cui gene si è poi duplicato e i due prodotti sono andati incontro ad evoluzioni indipendenti.
• Uno dei due geni ha dato origine alla mioglobina e l’altro gene ha dato origine a tutte le altre globine tramite successivi processi di duplicazione genica ed è presente una famiglia alfa di cui fanno parte le catene alfa e zeta e una famiglia beta che ha dato origine alla globina beta, delta, epsilon e gamma.
• Più lontano nel tempo è l’evento di duplicazione genica, maggiore è il numero di mutazioni, ci sono mutazioni puntiformi insieme a tagli che portano catene di diversa lunghezza.
• la mioglobina, catene della famiglia alfa e catene della famiglia beta non hanno la stessa lunghezza.

Proteine Modulari

• Sequenze amminoacidiche costituite da 40-100 amminoacidi (moduli) sono identiche all’interno di proteine completamente diverse, come se dei frammenti di geni fossero stati incorporati all’interno di geni più grandi.
• Si sfrutta questa possibilità di spostare frammenti nucleotidici da un gene all’altro in modo da dar luogo ad una catena polipeptidica in grado di svolgere una certa funzione in proteine completamente diverse, accomunate dal fatto che tutte queste proteine devono svolgere questa funzione ed è una strategia evolutiva che permette di risparmiare tempo, piuttosto di aspettare che avvengano mutazioni e duplicazioni geniche, molto più lente.
• Le proteine modulari sono dunque costituite da più moduli, ognuno con diversa funzione e rappresentato da un simbolo colorato di una certa forma.
• I domini di sequenza hanno origine da questi moduli di sequenza e riguardano la struttura terziaria.

Struttura Secondaria e Conformazione di una Proteina

• La struttura secondaria fa parte delle strutture superiori.
• Fa parte anche della struttura terziaria ed eventualmente della struttura quaternaria.
• Si arriva a costituire la struttura tridimensionale della molecola.
• Una proteina, per svolgere la sua funzione deve assumere il livello massimo di organizzazione strutturale.
• L'organizzazione strutturale complessiva determina lo stato nativo della proteina, l’unica conformazione a cui corrisponde lo stato funzionale.
• Se la proteina perde il livello strutturale superiore attraverso un processo di denaturazione, pur avendo la sequenza amminoacidica intatta, non svolge più la sua funzione.
• Il processo attraverso cui la proteina assume la sua conformazione nativa viene chiamato folding, si svolge spontaneamente e molto spesso è assistito da proteine che facilitano questo processo.
• Non sempre il folding va a buon fine.
• Lo stato nativo della proteina è unico anche se possono esserci delle eccezioni.
• Determinano un certo tipo di ripiegamento della catena:
• Interazioni con il solvente in cui è disciolta la proteina, nella cellula è l’acqua; sequenza amminoacidica; pH e composizione del solvente.

Sintesi del Riegamento e Legame Peptidico

• In laboratorio possiamo indirizzare il processo di ripiegamento come vogliamo, utilizzando solventi diversi.
• In vivo abbiamo un ambiente diverso, dove c'è un affollamento molecolare molto importante e quindi la catena polipeptidica non si ripiega in un ambiente libero, ma entra in contatto con molecole di altro tipo, talvolta rendendo il processo di ripiegamento complicato.
• Abbiamo cellule organizzate in modo da ottimizzare il processo, perché un ripiegamento che non va a buon fine crea conseguenza gravi.
• Nell’immagine si vedono le formule limite, la forma corretta è quella al centro con le cariche parziali, ma se dobbiamo scrivere la formula si usa la forma di sinistra.
• Il legame peptidico ha parziali caratteristiche di un doppio legame quindi è rigido e planare.
• La risonanza elettronica conferisce una notevole stabilizzazione, la stabilizzazione di risonanza è di circa 88 KJ/mol.

Catena Polipeptidica e Angoli di Rotazione

• L'immagine riporta una catena polipeptidica, ovvero i piani che raccolgono gli atomi che partecipano alla formazione di un legame peptidico.
• Ogni piano è immodificabile visto che non è possibile ruotare attorno al legame e favorito è il trans, visto che soltanto nel legame X-Pro (prolina) si può passare dalla configurazione trans a quella cis con un ribaltamento di 180°.
• 66 atomi sono posizionati sullo stesso piano e ogni piano è collegato ad un altro a livello dei carboni alfa, che rappresentano un punto di snodo ed è possibile ruotare sia attorno al gruppo amminico che attorno all'ex gruppo carbossilico (gruppo CO).
• Gli angoli di queste rotazioni vengono misurati attraverso angoli torsionali.
  • L’angolo ɸ (fi) misura l’angolo tra carbonio alfa e l’azoto.
  • L’angolo Ѱ (psi) misura la rotazione tra il carbonio alfa e il carbonio carbonilico.
• Stabiliamo il valore 0 di entrambi questi angoli. Il valore 0 è definito quando due piani peptidici adiacenti compongono nel loro insieme un piano unico.

Interferenze Steriche e Ramachandran

• Questa situazione non può esistere nella realtà perché l’atomo di ossigeno si trova troppo vicino all’idrogeno dell’NH del piano adiacente e si andrebbero a violare le regole dell’interferenza sterica, creando repulsione.
• Possono esserci delle situazioni che variano per angolazioni di ɸ e Ѱ, per esempio:
• ɸ = 0°, Ѱ = 180° gli atomi di ossigeno dei due piani sono troppo vicini.
  • Situazione non reale-.
• ɸ = 180°, Ѱ = 0°,gruppi NH dei due piani troppo vicini.
• ɸ = -60°, Ѱ = 180°, tutti gli atomi si trovano ad una distanza adeguata.
• Si deve tenere presente che per la misurazione degli angoli non si va da 0° a 360°, ma da 0° a 180° girando in senso orario e da 0° a -180°girando in senso antiorario, che rappresentano comunque un angolo giro.
• Ramachandran ha studiato sistematicamente tutte le conformazioni di un piano rispetto all'altro.
• Il grafico riporta sull'asse y i valori di Ψ e sull'asse x i valori di þ.
• Solo le coppie di angoli torsionali che ricadono nelle aree colorate in verde del grafico in foto sono conformazioni permesse. Quelle che si trovano nella zona più scura sono le più favorevoli.
• Ci sono eccezioni, come la glicina la cui catena laterale è costituita solo da un atomo di idrogeno e crea poco ingombro sterico.
• Per un polipeptide formato da sole glicine le conformazioni consentite saranno molte di più.
• Ci sono cerchi verdi che indicano coppie di valori degli angoli torsionali, si parla del foglietto β parallelo e antiparallelo, della a-elica e dell’elica di poliprolina 2, che non troviamo in natura, vista la struttura del collageno,.
• L’angolo omega è attribuito alla configurazione trans mentre la configurazione cis è 0°. I puntini viola, ricadono nelle aree preferite, mentre le coppie escluse rappresentano coppie valide per la glicina.